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1. 概述
PuriMagTM G-Hydrazide酰肼活化磁性纳米微粒是均一的、聚合物包覆的超顺磁纳米粒,亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性、低非特异吸附和易操作性,表面涂有高密度的酰肼官能团官能团。它通过形成稳定的共价键,广泛用于定点固定含醛或酮的配体,例如抗体、凝集素、糖蛋白和碳水化合物。 PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠可用于通过氧化糖基团获得醛基从而固定糖蛋白。它是固定多克隆抗体的理想选择,多克隆抗体包含位于分子Fc部分的大量碳水化合物。由于此类抗体仅通过Fc部分与磁珠偶联,因此它们的抗原结合位点不受阻碍,可以正确定向,从而提供了更高的纯化能力。如果某些单克隆抗体包含足够量的碳水化合物,则可以使用酰肼磁珠固定化。
固定化化学使高碘酸钠氧化多糖部分糖基中的顺式乙二醇基团。然后,生成的醛与磁珠上的酰肼基自发反应,形成稳定的共价键。偶联条件在时间和温度方面是灵活的。长的间隔臂减少了空间位阻,并且支持物具有最小的非特异性结合特性,这使其成为用于亲和色谱的极佳磁珠。
特点和优点:
w 共价高效配对;
w 稳定的共价键和低水平的配体泄漏;
w 产生可重复使用的免疫亲和基质;
w 低特异性结合;
w 固定1~20 mg蛋白质或0.1~2mg肽/ 磁珠;
磁珠偶联基本原理:
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Hydrazide groups
Group density
~300 µmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in in 1M NaCl and 0.02% NaN3
Stability
pH 3.5~10, 4~50 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意:以下方案是将蛋白或多肽与PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠偶联的示例。强烈建议进行滴定,以优化用于每种单独应用的磁珠量。该协议可相应地按比例放大和缩小。应避免使用含有伯胺或糖的Tris或其他缓冲液,因为它们会与预期的偶联反应竞争。
A. 所需材料
1)磁力架(用于手动操作):用于容纳12个单独的1.5~2ml离心管(Mrack02);用于容纳2个50 ml离心管或2个15 ml离心管(目录号Mrack03)
2)偶联缓冲液:0.1 M sodium phosphate, pH 7.0 or 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.6
3) 氧化试剂: Sodium meta-Periodate (NaIO4)
4)Sephadex G-25 column
5)洗涤缓冲液:1M NaCl
B. 蛋白偶联
B-1. 糖蛋白的氧化
注意:该反应对光敏感,应在黑暗中进行。
1)在1 ml偶联缓冲液中溶解或稀释0.5~10 mg糖蛋白。 (注意:如果蛋白质已经悬浮在其他缓冲液中,请通过透析脱盐柱进行缓冲液交换。
2)将蛋白质溶液添加到含有2 mg偏高碘酸钠(最终浓度为10 mM)的琥珀色小瓶中。轻轻旋转以溶解氧化剂。)
3)轻轻旋转,在室温下于黑暗中孵育样品30分钟。
4)终止反应,并通过Sephadex G25色谱柱进行脱盐和缓冲液交换,除去未反应的NaIO4。平衡5毫升。具有偶联缓冲液的Sephadex G-25色谱柱。将氧化后的样品上样至色谱柱,使其进入凝胶床。应用0.5 ml的偶联缓冲液冲洗,并使其也进入凝胶床。最后加入2 ml偶联缓冲液并收集洗脱液。
B-2. 以酰肼为末端的磁珠的偶联
注意:称重,用1mM EDTA(浓度:30 mg / ml)悬浮PuriMagTM磁珠,剧烈涡旋分散磁珠并在4°C储存。使用前先摇晃瓶子以完全重悬磁珠。
1)将完全悬浮的0.5 ml磁珠(30 mg / ml)转移到微量离心管中。
2)将离心管插入磁力分离器中1-3分钟,直到上清液澄清。当试管保留在分离器中时,用移液管吸出并丢弃上清液。从分离器中取出试管,并用1.5 ml偶联缓冲液重悬磁珠
3)重复步骤2~3次。
4)从分离器中取出离心管,并用750 µl偶联缓冲液重悬PuriMagTM磁珠。
5)将磁珠与250 µl氧化蛋白溶液混合,并在室温下孵育至少6小时。
注意:偶联效率取决于目标糖蛋白的结构和大小。使用者应根据经验优化蛋白浓度。对于10 mg磁珠,我们建议从100~250 µg/ml开始。
6)用1 ml洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。
7)用1 ml所需的存储缓冲液洗涤磁珠3次。
8)用0.1%叠氮化物(w / v)将珠子重悬于PBS缓冲液中至所需浓度,并保存在4°C直至使用。不要冻结。
C. 一般亲和纯化方案
注意:设计通用的纯化DNA或RNA的方案相对简单,因为核酸的生化特性相对一致。但是,设计一种通用的亲和纯化方案非常困难,因为每种蛋白质都有不同的组成和结构。为了获得最佳结果,每个用户都必须为各个应用程序确定最佳工作条件。
1)将最适量的PuriMagTM磁珠转移到离心管中。磁分离1~3分钟,除去上清液。
注意:强烈建议根据粗样品中目标蛋白的量进行滴定,以优化用于每种应用的磁珠的量。所用磁珠过多会导致较高背景,而所用磁珠太少则会导致较低产量。每mg的磁珠通常结合1~20 ug的目标蛋白。
2)取下离心管,用5倍磁珠体积的PBS缓冲液悬浮30秒。磁分离1~3分钟,除去上清。
3)重复步骤2两次
4)将洗涤过的磁珠加入含有目标蛋白的粗样品中,并在室温或所需温度下孵育1~2小时(较低的温度需要更长的孵育时间)。
5)用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl充分洗涤磁珠,直到280 nm洗脱液的吸光度接近背景水平(OD 280 <0.05)。