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用于组氨酸标签蛋白纯化的Ni亲和磁珠

2018-1-27 19:34:46点击:

1.       组氨酸标签蛋白

蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能与多种金属离子(Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等)发生特殊的相互作用,这些作用包括配位结合、静电吸附、共价键结合,其中以配位结合为主,而且这其中又以His-Tag标签成为蛋白纯化的首选标签:

a)         N末端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;

b)        采用固定化金属离子亲和层析纯化His-tag融合蛋白操作简便;

c)         His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,而不像GST标签那样容易形成而具体,从而影响蛋白特性;

d)        His-Tag非常小,不会改变目的蛋白自身的可溶性,相反一些大的标签如MBP,可大大提高融合蛋白的可溶性,尽管目的蛋白本身是不可溶或者折叠不正确;

e)         His-Tag非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响;

f)         N末端的His-Tag可通过蛋白内切酶去除;

g)        His-Tag既可用于活性蛋白表达的纯化标签,也可用于包涵体表达的纯化标签。

在重组蛋白末端融合多个组氨酸成串的肽段(如图1-1),凭借其与二价金属离子的螯合作用(如图1-2),从而利用亲和作用纯化蛋白。标签长度及暴露程度常影响标签与金属离子的相互作用,常用的His标签是6个重复的组氨酸,但在实际操作过程中,根据实际情况可控制组氨酸数目从4-10个不等。较短的标签与金属离子的结合更弱,较长的标签与金属离子的结合更强;而金属离子只能和蛋白表面的 His 结合,所以 His 标签暴露程度越高,结合能力越强。金属螯合亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC,如图1-3),为His-Tag纯化标签的重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。


1-1. His-Tag绿色荧光蛋白


1-2. His-TagNi2+的螯合作用



1-3. 金属螯合亲合层析柱

His-Tag标签也存在一些缺点,主要有:

a)       His-Tag有可能被降解脱落;

b)      在金属离子存在下可能形成二聚体或四聚体;

c)       在其它蛋白含相邻组氨酸残基的情况下,洗脱时可能会带入杂蛋白。

 

1.       His-Tag蛋白磁分离纯化流程

传统的His-Tag蛋白多利用金属螯合亲合层析柱进行层析分离。磁性纳米粒子作为一种新型的介质,利用其在磁场下可快速分离的特点,通过在磁珠表面螯合Ni2+离子,进而将其用于His-Tag蛋白的纯化,具有速度快、容易放大、可自动化操作等诸多优点。His-Tag蛋白通过磁性介质进行分离纯化的一般流程是裂解、吸附、洗涤、洗脱四个步骤,如图1-4所示,在流程中经常在洗脱步骤之前增加若干洗涤步骤以除去吸附较弱的非His-Tag蛋白,以期获得纯度更高的目标蛋白。

pH是影响蛋白结合和洗脱的重要因素,一般来说,结合发生在中性偏碱的环境(6.5 - 8.0),洗脱多在偏酸性的环境(< 6.0)。His标签蛋白在中性或弱碱性pH值(pH7到8)环境下显现出比在酸性条件下与金属离子更强的结合能力。在磷酸缓冲液中His标签蛋白表现出比在Tris-HCl缓冲液中与金属离子更强的结合能力。咪唑由于可以和His标签蛋白竞争与金属离子的结合,所以缓冲液中咪唑浓度的升高,会导致His标签蛋白与金属离子结合能力的减弱。一些可以鳌合Ni离子的试剂如EDTA或柠檬酸等等蛋白与金属离子的结合能力有较大影响,应避免使用。蛋白分离过程主要涉及细胞裂解结合液、洗涤液和洗脱液。

a)       细胞裂解结合液Lysis buffer(Buffer pH,Salt concentration,Stabilizer)

pH:>pI还是<pI;

NaCl:100-300 mM;

Glycerol:5-15 %,…CPI, mild detergent, β-ME

b)      洗涤液Washing Buffer

Lysis buffer + imidazole (1-40 mM) varies from protein to protein

c)       洗脱液Elution Buffer

Lysis buffer + 100-300 mM imidazole


图1-4. 磁性介质分离纯化His-Tag蛋白的一般流程

 

缓冲液配置基本原则:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或高pH上样,低pH洗脱,如图1-5。



a)       pH对组氨酸电离的影响

b)      咪唑与组氨酸的竞争结合

1-5. 组氨酸标签蛋白洗脱原理

 

固定化金属亲和磁珠(immobilized metal affinity magnetic bead, IMAMB)可以用于可溶性蛋白和包涵体蛋白的纯化,两种方法所需缓冲液不同,具体配置方法表1-1和表1-2。

表1-1. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

名称

体积

配方

结合缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53 g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36 g imidazole)
使用HCl溶液调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

清洗缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53 g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36 g imidazole)
使用HCl溶液调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

洗脱缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53 g NaCl)
300 mM Imidazole (20.4 g imidazole)
使用HCl溶液调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

 

表1-2. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

名称

体积

配方

结合缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

清洗缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl溶液调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

洗脱缓冲液

1L

50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
300 mM Imidazole (20.4g imidazole)
使用HCl溶液调节pH8.0
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

 

上述缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化,在结合缓冲液中添加一定浓度的咪唑可以降低非特异性结合,提高目的蛋白的纯度。初次使用的客户,可以采用推荐的缓冲液,再根据实验结果进行调整缓冲液配方及缓冲液中的咪唑浓度。

固定化金属离子介质是非常稳定的,但在有螯合剂的情况下其金属离子就会脱落,所以在纯化His-Tag融合蛋白时,通常螯合剂EDTA和EGTA必须从溶液中去除。Audur Magnusdottir等人认为,在E. coli的裂解液普遍存在一些非特异的弱螯合剂,如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质;E. coli在面临某些压力情况下,会产生高特异性的金属螯合剂——Metallophores,这是由于这些螯合剂的存在导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。这些螯合剂一般存在于细菌的细胞周质中,可通过一个简单的步骤除去这些螯合剂,使得His-TagTM蛋白的纯度和产量得到提高。固定化金属离子介质通常需要考虑在表1-3所列试剂中的稳定性。

表1-3. 固定化金属离子介质稳定性考察因素

Reagents

Stability

Reductants

还原剂

5 mM DTE

0.5-1mM DTT

20 mM β-mercaptoethanol

5 mM TCEP

10 mM reduced glutathione

Denaturants

变性剂

8 M urea

6 M Gua-HCl

Detergent

表面活性剂

2% Triton™ X-100 (nonionic)

2% Tween™ 20 (nonionic)

2% NP-40 (nonionic)

2% cholate (anionic)

1% CHAPS (zwitterionic)

Other additives

其它添加剂

500 mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100 mM Na2SO4

1.5 M NaCl

1 mM EDTA

60 mM citrate

Buffer

缓冲液

50 mM sodium phosphate, pH 7.4

100 mM Tris-HCl, pH 7.4

100 mM Tris-acetate, pH 7.4

100 mM HEPES, pH 7.4

100 mM MOPS, pH 7.4

100 mM sodium acetate, pH 4

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