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His 标签纯化常见问题|组氨酸标签蛋白磁珠纯化常见问题

2018-1-27 19:38:21点击:

1.蛋白不挂磁珠

蛋白不挂磁珠说白了就是蛋白和磁珠的结合能力不足导致的。根据影响结合能力的因素,可按照以下思路来排查原因。

1)His标签还在吗?大肠杆菌表达外源蛋白过程中,有时候会出现序列丢失的现象,若是标签丢失,蛋白自然无法挂柱了。那么检测方法也很简单,找个 His抗体通过 Western-Blot 检测下立马知道结果了。

2)标签表达以后暴露在蛋白表面吗?在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变性剂看下蛋白能不能挂磁珠,若此时可以挂磁珠,说明蛋白表达过程中His标签可能暴露不充分。这个时候,可以尝试在变性剂存在条件下纯化,若不能接受变性条件纯化,只能尝试上游修改了,要么增加 His 标签长度,增加暴露在外面的His个数,要么修改 His 添加的位置。

3) 选择了什么金属离子?如果选择的是 Ni2+或者 Co2+,换成作用力更强的 Cu2+或者 Zn2+可能可以解决问题。

4)缓冲液条件对吗?如果发现缓冲液中竟然出现了EDTA等鳌合剂,必须要去掉哦。此外适当提高缓冲液pH、降低缓冲液中的咪唑浓度、调整缓冲液中的盐浓度或者更换成磷酸缓冲液都可能提高 His 标签蛋白的挂磁珠能力。

5) 接触时间够吗?适当尝试延长接触时间,可能提高挂磁珠能力。

 

2.蛋白结合磁珠后洗脱不下来

蛋白无法挂磁珠是结合能力不足导致的,那么挂磁珠后洗不下来自然是因为洗脱条件太温和不至于破坏较强的作用力造成的。因此可从以下角度思考解决:

1) 洗脱强度不够?增加洗脱的咪唑浓度或者降低 pH 进行更加剧烈的洗脱。

2) 蛋白和磁珠有其他非特异的吸附?洗脱缓冲液中加入去垢剂(0.2% 的 TritionX-100)进行洗脱。

3) 改变缓冲液条件:降低缓冲液的pH、提高咪唑浓度、调整盐浓度或者换成Tris-HCl缓冲液有可能都能帮到忙。当然,EDTA这些鳌合剂因为直接和金属离子作用还是不要添加了。

4)减少接触时间:结合能力已经这么强了,适当减少接触时间加速试验是个不错的选择。

5)更换金属离子:如果现在用的是 Ni2+,换成 Co2+离子可能可以解决问题。

6) 上述都不行的话,只能回头重新进行载体构建了,尝试减少添加的 His 数目了。

 

3. 蛋白纯度不够

从His标签纯化的原理我们知道,只要蛋白中有His和金属离子都有一定的结合能力,所以根据样品中杂质蛋白的不同,纯化得到的蛋白纯度一定会有差异的。我们能做的是尽量提高目的蛋白的纯度:

1)优化金属离子:纯度不够主要原因是宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白结合在了磁珠上,那么我们可以通过更换成结合能力较弱的Co2+离子,使得含有His的杂蛋白无法结合,而标签蛋白可以结合,从而提高最终得到的蛋白的纯度。

2) 优化结合洗脱条件:找最适合的结合洗脱条件,将标签蛋白和杂蛋白尽可能分开。

3)双标签纯化:Strep II也是一个长度较小(8个氨基酸)的标签,可以在重组蛋白上同时添加His标签合Strep II标签,通过两步亲和分离,必能提高目的蛋白纯度。

 

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