关键要点——选择合适的提取策略

按用例的决策摘要

• qPCR / RT-qPCR：用于低通量的硅质自旋柱;自动化磁珠以提升通量。一定要核实A260/A230≥2.0。为RNA模板添加柱上DNase I消化。
• 简读NGS：偏好磁性珠。严格消除盐的残留物以保护连接酶并保持文库的复杂性。
• 长读NGS：仅限磁珠或纳米结合矩阵。离心柱在结构上与HMW DNA完整性要求不兼容（GQN ≥7.0）。
• 临床诊断：全自动化、获得IVD认证的磁珠平台，集成LIMS系统。没有手动方法。
• 具有挑战性的样本类型：将裂解化学成分匹配基质——植物组织用CTAB，FFPE用扩展蛋白酶K，低输入DNA用糖原载体。

使用场景	最高优先级	避免	推荐方法
qPCR / RT-qPCR	抑制剂移除;A260/A230 ≥ 2.0	酚的继承;跳过RNA的DNase	旋转柱或磁珠
短读国家地理学会	化学纯度;连接酶保护	混乱性盐的转移	磁珠
长读 NGS	HMW DNA完整性（GQN ≥7.0）	旋转柱;任何离心剪切	磁珠 / 纳米结合
临床诊断	可重复性;LIMS 可追溯性	手动移液;未验证方法	自动IVD认证磁珠
低输入 / cfDNA	集中力与恢复	RNA测序的载体RNA;无提取方法	带糖原载体的磁珠

常见问题解答

核酸提取和DNA纯化有什么区别？

       提取包括细胞裂解和核酸从细胞基质中释放。纯化通过去除PCR引物、酶或凝胶成分来清洗已释放的DNA——无需裂解。

哪种提取方法能保存高分子量DNA，用于长读序列测序？

       磁珠方法能完整保存巨碱级DNA。离心剪切使基因组DNA片段低于50 kb，因此与PacBio Revio要求的≥70%片段>10 kb不兼容。

我怎么知道提取出来的DNA是否带有抑制剂残留？

       A260/A230比值低于1.5明确表示鸟镵盐、酚或乙醇的携带。数值必须接近2.0，以避免PCR抑制和人为升高的Cq值。

为什么植物组织提取在标准方案下会失败？

       多酚、多糖和次级代谢物会使聚合酶失活。CTAB缓冲剂配合PVP和还原剂（DTT/β-巯基乙醇）来封存这些抑制剂——标准缓冲剂失效。

对于需要CLIA/IVDR合规的临床诊断，哪种提取方法最好？

       全自动化、获得IVD认证的磁珠平台，集成LIMS系统。它们精确复现时间、温度和体积，确保LoD性能的验证和批次可追溯性。