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抗体/核酸偶联过程中常用交联剂简介

2018-11-13 16:39:17点击:
(一)亚氨酸酯类
亚氨酸酯类交联剂可与伯氨基反应形成酰胺键。形成的酰胺键是质子化的,所以在生理pH条件下带有正电荷。亚氨酸酯类的同双官能团交联剂常用于蛋白质分子结构、膜表面分子相互作用及蛋白质分子固相表面固定等方面的研究。此外,亚氨酸酯类的交联剂还可以作为戊二醛的替代物用于组织固定。亚氨酸酯类的交联剂可以自由通透细胞膜,所以可以交联膜蛋白,研究膜构成、结构和蛋白-蛋白相互作用及蛋白-脂质相互作用。此类交联剂还可以用于研究多亚基复合体内部不同亚基的数量和相互定位。此种反应中,通常使用过量的交联剂(100-1000倍)和低浓度蛋白( <1mg/ml),以提高分子内部的交联效率。

亚氨酸酯类交联剂在碱性条件下可以与氨基发生快速反应,但是其半衰期很短。如果pH值再增加,那么半衰期和氨基反应性也会相应提升。所以,pH10的条件下,交联效率高于pH8的条件。虽然酰胺键形成的最佳条件是pH8-10,但是当pH值低于10时容易发生副反应。使用单功能的烷基亚胺酯的研究表明,pH值小于10时,交联反应只在一个亚氨酸酯基团上发生。中间产物N-烷基亚胺酯在低pH值条件下形成,会与相邻氨基反应形成N,N+ -酰胺衍生物,这种衍生物最终也可形成酰胺键或是其他副产物。当pH值大于10时,亚氨酸酯类交联剂形成的酰胺键可以断裂,所以为寻求更为有效稳定的交联效果才出现了NHS酯类交联剂。


(二)N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)
NHS酯可以在生理pH值条件下和伯氨基形成十分稳定的酰胺键。蛋白质N端的a-氨基和赖氨酸残基的e-氨基都可以与NHS酯形成酰胺键。

NHS酯与伯氨基形成十分稳定的酰胺键后,释放出N-羟基琥珀酰亚胺。NHS酯遇水会发生水解反应,并且水解的速度随着pH值的增加而增加。如果蛋白质溶液浓度较低的话,那么NHS酯水解反应就会稳定进行。PH7.0和0℃的条件下,双官能团 NHS酯交联剂在无伯氨基水溶液中的水解半衰期为4耀5个h。如果pH值8.6和4℃条件下,时间会缩短为10min。NHS酯交联剂在无伯氨基水溶液中的水解程度可以通过260nm的OD值来检测。NHS酯水解后释放的N-羟基琥珀酰亚胺会造成OD260nm值的升高。水解生成的N-羟基琥珀酰亚胺在pH9条件下260nm的分子消光系数为8.2×103/(cm·mol/L)。在pH6.5的50mmol/L磷酸钾缓冲溶液中的分子消光系数为7.5×103/(cm·mol/L)。

NHS酯可以在无伯氨基的离子缓冲溶液中与蛋白的伯氨基发生特异的交联反应。常用的缓冲体系包括浓度在50耀20mmol/L之间的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES或硼酸盐缓冲溶液。Tris碱含有伯氨基所以不能用于NHS酯交联反应的溶液配制,但是可以用于NHS酯交联反应的中止。通常,中性至碱性条件下的NHS酯交联反应都可以在反应结束时通过添加过量的Tris碱来停止反应。甘氨酸由于含有伯氨基所以也同样可以用于反应的中止。NHS酯交联反应的条件通常为4℃或室温下,pH7-9,反应30min至2h。4℃反应条件下需要适当延长时间才能达到室温下的反应效率,一般延长至4倍时间左右。NHS酯的用量是2-50倍过量于蛋白的量,具体的用量还需要根据蛋白溶液的浓度来确定。NHS酯的反应浓度通常会在0.1-10mmol/L之间变动。蛋白溶液的浓度需要超过10μmmol/L,最后是在50-10μmmol/L之间,这样才能避免交联剂的水解反应。

NHS酯可以分为水溶性和水不溶性两类。水溶性NHS酯在N-羟基琥珀酰亚胺环上带有磺酸基,这适用于不能耐受有机溶剂的交联反应。硫酸化NHS酯通常在纯水相中反应,并且当溶液中存在DMSO时溶解度会显著降低。水溶性NHS酯主要用于细胞表面的分子交联反应,因为它们不能通透细胞膜。硫酸化NHS酯以钠盐形式出售,有效浓度大于10mmol/L。水不溶性 NHS酯的溶解度会根据溶液的组成成分而变化。最初,该类交联剂主要溶解于可与水相混溶的有机溶液中,如DM-SO、DMF等。水不溶性NHS酯不带电荷所以可以通透细胞膜。通常,有机溶剂的浓度为0.5%-10%。NHS酯的交联反应可能会造成蛋白活性的丧失,这是因为参与反应的伯氨基可能位于蛋白的活性中心,或是对蛋白的活性是至关重要的。

(三)马来酰亚胺类
巯基作为备选的交联基团具有以下优点:交联位点确定,交联反应可逆,可以实现顺序交联反应。马来酰亚胺可在 pH6.5-7.5的条件下与巯基发生特异性反应形成稳定的巯醚键。中性 pH值条件下,马来酰亚胺与巯基反应的速率快于氨基1000倍。但是pH大于8.5时,反应更倾向于氨基。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸和甲硫氨酸发生反应。马来酰亚胺在溶液中也会发生水解反应,尤其是在pH值大于8.0的条件下。水解反应会与巯基交联反应发生竞争。反应溶液中应该避免自由巯基的存在。同样,巯基化合物也可用于马来酰亚胺交联反应的终止。反应缓冲体系中添加 EDTA可以避免巯基的氧化。


(四)卤乙酰基类
最为常用的α-卤乙酰基类交联剂含有可以在生理pH值条件下与巯基反应的卤乙酰基团。为保证巯基反应的特异性,通常选择pH8.5条件,并且卤乙酰基交联剂轻微过量。卤乙酰基交联剂大量过量会与其他氨基酸发生非特异性反应。咪唑可以与卤乙酰基类在pH6.9-7.0条件下发生反应,但是反应孵育时间必须超过一周。为抑制游离碘的生成,卤乙酰基交联反应应该闭光进行,因为游离卤素可以与酪氨酸、组氨酸和色氨酸残基发生反应。常用的NHS酯卤乙酰基双官能团交联剂包括SIA、SIAB和硫化SIAB等。


(五)二硫代联吡啶
二硫代联吡啶可与巯基在较宽pH值范围内发生反应形成二硫键,最佳pH值为4-5。由于反应后产生2-硫吡啶,因此可以通过检测其在343nm的吸光度值判断反应进行的程度。常用的二硫代联吡啶类交联剂包括LC-SPDP、硫化LC-SPDP和PDPH。


(六)酰肼类
羰基化合物(醛酮类)可与酰肼和氨基在pH5-7的条件下反应,与酰肼的反应速度快于氨基。此类交联剂可以用于位点特异性的交联反应。蛋白质分子中所含有的羰基并不是十分稳定,但是多糖链经高碘酸钠轻度氧化后会经邻近的羟基氧化成为醛基或酮基。通常此类氧化反应都是在闭光0-4℃条件下进行的,以此避免副反应的发生。随后添加酰肼就可以形成腙键。此种交联反应主要用于抗体的修饰方面,因为抗体的Fc段通常含有碳水化合物。0℃,1mmol/L高碘酸钠条件下,氧化反应仅限于唾液酸残基。如果浓度提高到6~10mmol/L水平,那么蛋白分子中的其他碳水化合物也可以参与反应。


(七)碳二亚酰胺类
碳二亚酰胺可以介导羧基与氨基或酰肼的反应,生成酰胺键或腙键。由于蛋白的末端及侧链通常都含有羧基和氨基,所以使用此类交联剂会造成蛋白多聚体的形成。所形成的共价键类似于蛋白分子的肽键,所以是十分稳定的,如果不破坏蛋白是不可能打开形成的交联键的。

EDC〔1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基) -碳二亚胺〕是此类交联剂中使用最为广泛的一种,在半抗原的合成和酶的修饰中使用较多。其机制一般认为是蛋白残基的羧基先同EDC反应,生成活泼的中间产物O-酰基异脲(O-acylisourea),这个中间产物再与亲核基团,如氨基或羟基,发生反应。EDC本身在水中也很容易发生水解而失效。另外,pH值过高会使EDC及EDC与羧基反应的活化中间物的水解趋势增大。因此,EDC活化羧基最好是在酸性条件下进行。实际操作中,每次加入EDC前后,都要调节pH值在3耀5的范围内。MES〔2-(吗啉代) -乙烷磺酸〕是适用于碳二亚酰胺交联剂的缓冲盐。磷酸盐缓冲体系会降低EDC的反应效率,但增加EDC的量可以弥补交联效率的降低。Tris碱、甘氨酸和乙酸缓冲体系不能用于EDC的交联反应体系。NHS及硫化NHS常添加于EDC的反应体系中以增加交联效率。EDC和NHS联合使用活化羧基,最后可以得到NHS活化的特定位点。这样形成的NHS酯O-酰基异脲中间体不仅同样保留了对氨基的反应性,并且提高了中间体的稳定性。O-酰基异脲本身在酸性或是中性条件下半衰期只有几秒。但是,NHS酯活化后,半衰期最多可以延长至几小时,当然这还受到温度、pH值和交联剂结构的影响。


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