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1. 概述
PuriMag G-Iminobiotin是2-亚氨基生物素偶联的磁性纳米颗粒，用于磁性分离抗生物素蛋白、亲和素或链霉亲和素标记的组分。磁珠具有大的表面积和高捕获效率。
关于亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素和单体亲和素与生物素相互作用的文献中有很多。生物素与亲和素的结合非常强，KD约为10-15；据报道，链霉亲和素具有相似的 KD 值。然而，亚氨基生物素的解离常数要低得多，这与pH值有关。亚氨基生物素的 pKa 在 11-12 的范围内，碱的 KD = 3.5 x 10-11，但在 pH 值 3-4 时，质子化亚氨基生物素的 KD <10-3 .
>C=NH : >C= NH2+
high pH low pH
分离亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素复合物的条件极其苛刻，需要使用6M胍盐和pH 1.5。在这些条件下，大多数蛋白质完全变性，无法回收。亲和素和链霉亲和素在极端 pH 值下是稳定的，但与它们偶联的蛋白质不太稳定。使用亚氨基生物素标记物或亚氨基生物素磁珠，用乙酸盐缓冲液将pH值降低至约4通常足以使配体质子化，释放链霉亲和素标记的蛋白质。
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Streptavidin group
Group density
~150 μmol iminobiotin / g Beads
Binding capacity
≥30 μg streptavidin / mg Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in 0.5 M NaCl, 0.01 M sodium phosphate, pH 6.8, containing 0.02% sodium azide
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
A. 缓冲液（未提供）
1) 结合/清洗缓冲液：pH 值为 11 的 50 mM 碳酸铵或硼酸钠，含 0.5 M NaCl
2) 洗脱缓冲液：50 mM 乙酸铵或乙酸钠，pH 4.0
B. 分离程序
1. 吸取50 μL（0.5 mg）磁珠，每管加入1mL结合缓冲液洗涤磁珠。
2. 磁力分离2分钟或至上清液澄清。
3. 吸弃上清液。加入1 mL结合缓冲液再洗涤一次。
4. 重复步骤2.取出并丢弃上清液。
5. 加入450 μL结合缓冲液重悬磁珠。
6. 将50 μL血清或细胞培养上清液加入磁珠中。
注意：样本量可以根据用户偏好进行修改。如果样品上清液体积<500μL，用结合缓冲液稀释至终浓度为500μL。
7. 使用旋涡或旋转器轻轻混合30分钟。
8. 使用磁力分离器磁力分离2分钟或至上清液澄清。
9. 去除并丢弃上清液。
10. 加入500μL结合缓冲液洗涤磁珠，并除去未结合的蛋白。
11. 再次重复步骤8和9。除去上清液。
12. 将100μL洗脱缓冲液加入磁珠中并充分混合。
13. 在室温下孵育10分钟，偶尔温和搅拌或涡旋。
14. 将洗脱的样品脱盐或透析以转移到合适的缓冲液中。
C. 注意事项
通过类比固定化亲和素和 2-亚氨基生物素或其偶联物的洗脱，使用 0.1% （w/v） Triton X-100、吐温 80、脱氧胆酸钠可能不会干扰亲和分离。但十二烷基硫酸钠（SDS）的使用完全破坏了所有的结合。
辣根过氧化物酶和亲和素/链霉亲和素的碱性磷酸酶偶联物也可以通过2-亚氨基生物素磁珠纯化。磁珠在pH 10而不是pH 11下平衡，并使用pH 6缓冲液实现特异性洗脱。
在前面提到的类似系统中，使用pH 4.0缓冲液或使用含有1 mM生物素的50 mM Tris-HCl（pH 6.8）实现特异性洗脱。这样做的优点是需要酸性较低的缓冲液，但缺点是生物素选择性地（基本上是永久地）与亲和素磁珠结合，取代了亚氨基生物素类似物。
亚氨基生物素磁珠可以通过用 pH 11 缓冲液洗涤来再生，然后在 0-8°C 下储存在 pH 值为 7 的含有 0.5 M NaCl 和合适防腐剂的缓冲液中。
