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DNA提取经典方法之——植物组织DNA提取

2017-5-3 18:38:03点击:

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物,幼嫩叶子。


二、设备

移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。


三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris•Cl,pH8.0,20mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,1.5% SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240μl巯基乙醇,加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇


4、RnaseA母液


5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。


四、操作步骤


(一)水稻幼苗或其它禾木科植物DNA提取

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。

2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl),37℃ 10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。

10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1ml TE,-20贮存。

13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA,足供RFLP、PCR等分析之用。


(二).从李(苹果)叶子提取DNA

1.取3-5克嫩叶,液氮磨成粉状。

2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml,再研磨至溶浆状。10000rpm,10min。

3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml,混匀。65℃,30-60min,常摇动。

4.同本节(一)中步骤3-13操作。


(三).Purimag磁珠用于提取DNA

使用Purimag的核酸提取磁珠,可以高效提取植物组织DNA。通常在经典方法沉淀DNA步骤之前加入磁珠,即可让DNA吸附在PuriMag磁珠表面,洗脱后即可得到高纯度的DNA。