1. 文章来源

Li, L‑S., Ma, L., Chen, Y‑X. and Li, S., 2026. The CBP60b‑14‑3‑3 functional module regulates immunity in arabidopsis. Frontiers in Plant Science, 17, p.1916745. Available at: https://doi.org/10.3389/fpls.2026.1916745.

2. 摘要中英文对译

英文原文摘要

Transcriptional reprogramming is a critical process in plant immune responses, in which Calmodulin‑Binding Protein 60b (CBP60b), a plant‑specific atypical transcription factor family, plays an essential role. However, how its transcriptional activity is regulated during immunity remains unclear. Here, we report that 14‑3‑3 proteins, conserved scaffolding proteins in eukaryotes, interact with CBP60b in a calcium‑dependent manner and enhance its transcriptional activity on downstream genes. The 14‑3‑3 variant deficient in calcium binding, 14‑3‑3λ^G216A, disrupted the interaction with CBP60b and failed to fully complement the pathogen‑sensitive phenotype of the 14‑3‑3λ;k mutant. Furthermore, we show that the pathogen‑induced transcriptional upregulation of 14‑3‑3λ and 14‑3‑3k is dependent on CBP60b. Finally, genetic evidence demonstrates that 14‑3‑3s are required for CBP60b function. Collectively, our findings reveal that CBP60b and 14‑3‑3 proteins form an interactome‑mediated positive feedback loop to orchestrate immune responses in a calcium‑dependent manner.

中文译文

转录重编程是植物免疫应答的关键过程，植物特有非典型转录因子家族的钙调蛋白结合蛋白60b（CBP60b）在此过程中发挥关键作用。但CBP60b在免疫应答过程中转录活性的调控机制尚不明确。本研究发现，真核生物保守的支架蛋白14‑3‑3以钙离子依赖方式与CBP60b发生蛋白互作，并且增强CBP60b对下游靶基因的转录激活活性。钙离子结合缺陷突变体14‑3‑3λ^G216A与CBP60b的互作被破坏，该突变也无法完全回补14‑3‑3λ;k双突变体对病原菌敏感的表型。另外，病原菌诱导产生的14‑3‑3λ、14‑3‑3k转录上调依赖CBP60b。遗传学证据表明，14‑3‑3蛋白是CBP60b发挥生物学功能所必需的。综上，本研究揭示CBP60b与14‑3‑3蛋白形成蛋白互作介导的正反馈环路，以钙离子依赖模式协同调控植物免疫应答。

3. 文章使用磁珠详细介绍（来源、结构、特性、使用方法）

本文共使用两种磁性微球：直链淀粉磁珠amylose magnetic beads(PuriMag)用于体外Pull‑down蛋白互作；Anti‑Flag纳米抗体磁珠Anti‑Flag Nanobody Magarose Beads用于拟南芥原生质体Co‑IP免疫共沉淀。

3.1 直链淀粉磁珠 amylose magnetic beads（PuriMag Pro）

来源：商品名为amylose magnetic beads，品牌PuriMag Pro。

结构：磁性微球基质表面共价偶联直链淀粉（amylose）配体。

特性：特异性结合MBP（麦芽糖结合蛋白）标签融合蛋白；超顺磁性，依靠磁力完成固液分离，不需要离心柱，适合小体积体外Pull‑down互作实验；可以使用高浓度麦芽糖竞争性洗脱结合蛋白。

使用方法（Pull‑down实验）：

1. 在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达、纯化His‑14‑3‑3λ/k、MBP‑CBP60b重组蛋白。
2. 将纯化重组蛋白与amylose magnetic beads加入结合缓冲液（20 mM Tris‑HCl，0.2 M NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM CaCl₂，pH 7.4），4 ℃旋转孵育2 h。缓冲液添加1 mM CaCl₂，模拟体内钙离子环境。
3. 使用上述结合缓冲液洗涤磁珠5次，去除非特异性吸附蛋白。
4. 磁珠‑蛋白复合物加入上样缓冲液煮沸，SDS‑PAGE电泳，anti‑MBP、anti‑His抗体进行免疫印迹检测互作蛋白。

3.2 Anti‑Flag纳米抗体磁珠 Anti‑Flag Nanobody Magarose Beads

来源：Magarose，商品名Anti‑Flag Nanobody Magarose Beads。

结构：磁性琼脂糖（Magarose）微球基质，共价偶联羊驼源抗‑Flag(DYKDDDDK)VHH纳米单域抗体。

特性：纳米抗体特异性识别Flag标签；捕获Flag标签融合蛋白及其结合的互作蛋白；适用于植物原生质体样品Co‑IP免疫共沉淀实验。

使用方法（Co‑IP免疫共沉淀）：

1. 将pHBT‑Flag‑CBP60b分别与UBQ10:GFP（对照组）、UBQ10:14‑3‑3λ/k‑GFP共转染4周龄拟南芥原生质体。
2. 裂解缓冲液（50 mM Tris‑HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X‑100，蛋白酶抑制剂）提取总蛋白。
3. 蛋白提取液与Anti‑Flag Nanobody Magarose Beads混合，4 ℃孵育2 h。
4. 洗涤缓冲液（50 mM Tris‑HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM EDTA）洗涤磁珠5次，去除非特异吸附组分。
5. 磁珠加入蛋白上样缓冲液煮沸；SDS‑PAGE电泳，anti‑Flag、anti‑GFP抗体免疫印迹检测靶蛋白及其互作条带。