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磁珠法VS硅胶柱法,未来核酸提取方法谁主沉浮?

2016-7-20 21:06:19点击:

      15年前中国大部分的 实验室都还在使用酚氯仿抽提核酸,用户以为核酸纯化试剂盒都是来自国外的进口产品。  

      15年过去了,现在的分子生物学实验室酚氯仿抽提基本消失,Trizol试剂是硕果仅存,尚有普遍使用的酚氯仿核酸提取方法。还有一种方法是煮沸法,其原理是先加热变性蛋白,再离心去沉淀蛋白,最后取核酸上清。但是煮沸法本质上并未进行核酸纯化,只是把蛋白变性沉淀下来而已,因此它的缺陷也显而易见:核酸片段短,抑制物含量高,应用范围仅局限在PCR检测中--以扩增检测几百bp的目的片段为主,如果你想P一个5kb的基因,煮沸法提取的核酸几乎不可行,因为大部分核酸都已经降解成1-2kb以下的小片段了, 适合扩增的长片段模板含量太低。

      目前主流的核酸纯化方法只剩磁珠法和硅胶柱法了。那么应该选择磁珠法还是硅胶柱法呢?硅胶柱技术的厂家说磁珠法得率低,纯度差,效果不好;磁珠法厂家说硅胶柱法即将被淘汰,童靴们都糊涂了,到底咋回事?

      其实磁珠法和硅胶柱法原本是一家。Marko在1982年发表的文献:A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Anal. Biochem.121, 382-387,里面详细描述了如何用玻璃粉吸附DNA,并进行纯化的过程。

      玻璃的主要成分就是二氧化硅,磁珠只不过是在四氧化三铁的微球表面涂上一层二氧化硅(玻璃介质)而已。具体原理是什么呢?说实话小编也不是很清楚,据说核酸溶液是一种胶体溶液,外层有水化层和电荷层,水化层或是电荷层被夺走后就变得粘稠了--大家可以想象一下酚氯仿抽提后的水相,加醇了以后,界面出现了粘稠的核酸,可用玻璃棒粘走核酸--大概就是核酸的水化层被剥离后变得粘稠了,从而黏附到玻璃介质上了,看来玻璃(SiO2)确实是黏附核酸的好东东。

      极小的玻璃球就是玻璃粉或者是磁硅珠。一切似乎都很完美,可问题是,如果核酸太多了一点,就会把玻璃球黏在一起,紧密黏在一起的小团不仅黏住了残留的蛋白,还滞留了盐分,怎么解决?

      把玻璃棒拉细,超级细,直到变态细,就做成了玻璃纤维。把玻璃纤维叠个N层,当然还是疏松的,却不会像玻璃珠那样堆积在一起。于是蛋白不容易黏上,盐分也容易清洗掉了----这个就是做在纯化柱中的硅胶膜。

      这么说,硅胶柱法应该是玻璃粉法的升级版了?实测确实如此,硅胶柱法纯化核酸的纯度,回收效率都优于玻璃粉法。

      随着分子生物学的不断发展,要求全自动提取基因提上日程,大批量处理样本的医疗机构用户(那可是有钱人哦)对自动化的要求日益迫切。硅胶柱法需要高速离心机(大于10000g以上),其在自动化操作上异常困难,加载有硅胶柱的自动化核酸纯化仪器非常复杂,比如QIAGEN的QIAcube全自动核酸纯化仪 ,就整合了离心机、加热震荡器、移液体系和自动抓取器,虽然完整地延续了硅胶柱法的高纯度和高回收率的优势,但仪器价格昂贵,应用受到限制。

      于是磁珠法应运而生,在磁珠表面包上一层二氧化硅,替代传统的玻璃粉法,就可以实现磁场分离替代离心分离的作用,很容易实现仪器上的操作自动化,但是磁珠法仍然存在玻璃粉法的缺陷,提取的核酸纯度低、盐分残留高。

      因此,硅胶柱法不会消失--特别是科研用户,并不需要大批量的样本进行核酸纯化,更关注的是核酸的回收效率、纯度,这些却是磁珠法的硬伤。磁珠法更适合于低浓度核酸的提取,为了提高核酸提取的纯度,对磁珠表面改造也是重要的发展方向。