联系方式 Contact

地址:厦门市集美大道1300号

电话:15805933710

联系人:许先生

QQ:1974707632

微信:15805933710

邮件:purimag@139.com

在线QQ交谈 在线QQ交谈

搜索 Search
你的位置:首页 > 技术支持 > DNA/RNA提取

漫谈核酸的提取和纯化之四:RNA的分离与纯化

2017-6-22 9:22:25点击:

第四节        RNA的分离与纯化

包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料,mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品,RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。

RNArRNA的数量最多,占总量的80%85%tRNA及核内小分子RNA15%20%mRNA仅占1%5%。由于各种rRNAtRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚,从基因克隆、表达与诊断的目的出发,目前对RNA的分离与纯化,主要集中在总RNAmRNA上。

一、RNA制备的条件与环境

为防止RNaseRNA 的水解,一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性,二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase,应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕,并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

RNA提取的初始阶段开始,就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂(如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂)、蛋白的水解(如蛋白K)和能与蛋白质结合的阴离子去污剂(如SDSsarkosyl或脱氧胆酸钠等)并联合使用RNase的特异性抑制剂(如RNasinDEPC等)能极大地防止内源性RNaseRNA的水解。另外,在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dithiothreitolDTT)等还原剂可以破坏RNase中的二硫键,有利于RNase的变性、水解与灭活。

二、RNA的分离与纯化

由于RNase的影响,为获得完整的RNA分子,就必须在总RNA分离纯化的最初阶段,尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下,高浓度的()硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性,能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子,目前已成为常规使用的试剂。pH8.0Tris饱和酚用于DNA的制备,但在RNA纯化时,应使用pH4.55.5的水饱和酸性酚,这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管对剪切力不敏感,但RNA具有碱易变性,需要严格控制pH值。另外,在DNARNA的提取过程中,酚与氯仿经常结合、交替使用,主要在于两者合用时去除蛋白的效果更好,而且氯仿还能有效抑制RNase的活性,通过使酚脱水防止mRNA的丢失,加速有机相与水相的分层,去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入,其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用,为防止SDS的沉淀,常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品,加入糖原可以提高RNA的回收率。

RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是,目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA,由于其选择性地沉淀大分子rRNAmRNA,故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少,rRNAmRNA所占的比例相应增高。当然,目前的研究重点不是小分子量RNA,而是分子量较高的mRNA,不必苛求真正的总RNA

(一)()硫氰酸胍-酚氯仿一步法

()硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法,由ChomczynskiSacchi 1987年提出。它以含4mmol/L()硫氰酸胍与0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞,然后在pH4.0的酸性条件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。该法与以前的()硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比,具有简便、经济和高效的特点,能同时迅速地处理多个标本,且RNA的完整性与纯度均很高。目前仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量,每毫克组织总RNA的产量大约为47mg,每106个细胞大约为510mg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA,而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染,这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解,同时抑制RT-PCR反应,并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用()硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时,可下一个方法,通过增加一个有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。

(二)可同时制备RNADNA与蛋白质的一步法

该法是()硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法。它是以()硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞,然后加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面,保留于上层水相的RNARNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。其中RNA沉淀溶液的成分为1.2mmol/LNaCl0.8mmol/L的柠檬酸二钠。由于RNA沉淀溶液的使用,该法制备的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染,可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA,大小约为20kb,可作PCR反应的模板,蛋白质样品则主要用于免疫印迹。目前,该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择,是最常用的总RNA提取法,其产率与()硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。

(三)其它方法

RNA的分离纯化方法与方案还有许多,如()硫氰酸胍-CsCl超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、LiCl-尿素法、热酚法等,因各种原因目前已较少使用。使用purimag磁珠在分离各种不同样本的RNA均表现优异,更多核酸提取磁珠请参考普瑞迈格官方网站。


三、mRNA的分离与纯化


与大小和序列明确的rRNAtRNA及核内小分子RNA不同,真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外,绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸(polyadenylic acid)的结构,即poly(A)尾巴。以总RNA制品为起始材料,利用核酸的碱基配对原理,通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析,可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。理论上,它们可编码细胞内所有的蛋白质与多肽分子。

(一)oligo(dT)-纤维素柱层析法

oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱,加入待分离的总RNA样品,其中poly(A)+RNA在高盐条件下,通过碱基互补,与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体,洗去未结合的其它RNA,然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时,oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法,回收的poly(A)+RNA量可达总RNA1%10%。但该法分离速度慢,易阻塞,不适合同时对多个标本的处理,而且很难回收全部的poly(A)+RNA,故不适合对少量RNA样品的分离。

(二)oligo(dT)-纤维素液相结合离心法

为适应同时对多个标本进行处理的要求,应选用批量的层析法。oligo(dT)-纤维素液相结合离心法不经填柱,而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列的含不同RNA样品的微量离心管中,通过离心收集吸附有poly(A)+RNAoligo(dT)-纤维素,经漂洗后,用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNAoligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品,而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA。用本法分离poly(A)+RNA时,应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素,如oligo(dT)18-30纤维素,而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。

(三)其它方法

磁珠分离法则联合利用了oligo(dT)poly(A)的互补配对特性、生物素(biotin)与链亲和素(streptavidin)的特异性结合以及磁性分离原理,对poly(A)+RNA进行高效、灵敏、快速的分离(图6-4)。其产量甚至比常规的oligo(dT)-纤维素柱层析法还高,且分离的poly(A)+RNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1克,而且磁珠很贵并需要专门的磁性分离架。