尽管传统的填充床色谱法已经很成熟，但它需要大量的补料澄清以防止色谱柱堵塞。3 此外，多孔结构中的扩散传质很慢，并且由于大型生物制药模式的空间位阻，有效表面积减小。4

       与传统的小分子相比，生物制剂更复杂、体积更大，这使得这两个因素越来越受到限制。因此，替代分离技术对于克服这些瓶颈至关重要。此外，工艺强化为增强生物工艺提供了巨大的机会。工艺强化是集成工艺设计、新技术和设备的组合，通过减少生产时间、提高产品质量和最大限度地减少资源使用来提高整体生产力。正如我们将在本文中演示的那样，基于功能磁性颗粒的磁分离是一种非常有前途的工艺强化技术。

图 1. 常规扩散限制填充床色谱法和新型磁性分离原理的示意图。这两种技术都描述了使用基于蛋白 A 的配体纯化 mAb。（A） 在常规色谱中，使用功能性树脂的填充床，进料流通过该填料床。相比之下，（C） 磁分离依赖于功能性磁性颗粒 （MP），这些磁性颗粒在进料流中被搅动，并且可以磁性保留以进行缓冲液交换。（B） 两种技术的标准步骤包括将 mAb 与蛋白 A 配体结合、洗去杂质、洗脱 mAb 和再生基质。

1. 磁分离是一种新型下游工艺技术

       磁性分离依赖于磁性和非磁性材料的分离。传统上，它已应用于选矿、钢铁生产和废水处理等领域，以分离具有本征磁化的物质。5,6 此外，它在实验室的分析和诊断中得到了很好的应用，部分是在自动化高通量平台上。7 在过去的 10~15 年中，磁性分离技术在制备型生物分离中也越来越受欢迎（参见图 1C）。8 因此，生物材料选择性地与磁性颗粒 （MP） 结合，例如，磁性颗粒可以通过简单且廉价的共沉淀反应或天然来源产生。9 MP 的尺寸通常在 10 nm 至 100 μm 之间，由磁芯（例如氧化铁）组成，可以像在色谱法中一样使用特定应用的化学或生化涂层（例如，功能性硅烷或基于糖类的生物聚合物）和/或生物亲和配体（例如，蛋白质 A）进行修饰。磁性分离通常遵循与色谱相同的步骤（上样、洗涤、洗脱和颗粒再生，如图 1B 所示）。

       然而，与色谱中的流通柱不同，MP 在其各自的进料流/缓冲液中分散和搅拌，并且通过磁保留颗粒和更换液体来进行缓冲液交换（参见图 1C）。与标准色谱相比，分散颗粒吸附剂产生的一般无孔性带来了两个决定性的优势：增强大型物质的传质和未澄清进料的潜在处理。此外，MP 可能具有高靶标结合载量，这对于高效处理非常重要。

2. 磁性分离在下游强化方面具有很大的潜力

每个磁选工艺通常由三个主要组件组成，可以相应地进行调整：

• 磁性粒子 /
• 其表面功能化，以及
• 磁分离装置。

虽然由于生物制药应用的可用系统数量有限，分离机的选择相对简单，但进料流和最终目标会影响 MP 的选择及其功能化。在下文中，将讨论一些用例，它们为这三个组件提供了不同的选择（图 2）。

图 2.简化的示意图，举例说明了用于纯化新型、mAb 和重组蛋白的选定已报道的磁性分离研究。MP 可以用特定的官能团或配体修饰，以调节靶标的结合特异性。磁性分离技术的主要优点是可以集成澄清和捕获步骤，这些步骤通常由昂贵且耗时的离心、过滤和色谱单元作执行。

3. 单克隆抗体的纯化

       mAb 生产中上游工艺 （USP） 的强化导致通过灌流和高细胞密度发酵方法显著提高滴度。因此，DSP 现在面临着处理两种不同起始情况的挑战。

• 小体积高滴度的高细胞密度肉汤（补料分批）或
• 体积大，mAb 滴度低，但无细胞（灌注）。

       离心和过滤作必须处理更高的细胞浓度，而色谱步骤必须处理极高的体积或高度浓缩的负载。这对传统的纯化方法构成了重大挑战，并进一步强调了 USP 和 DSP 之间更好地保持一致的必要性。

       磁分离为这两个问题提供了潜在的解决方案。对于高细胞密度工艺，将离心、过滤和层析三个工艺步骤集成到一个分离步骤中可以解决高固体负荷的问题。相比之下，对于灌流培养，没有固定相意味着吸附与体积无关，因此处理时间显著缩短。

       磁性颗粒的独特特性有助于集成，并打开了一个材料平台，如果最终目标需要，可以定制，但复杂性会增加。它们的高适应性使色谱法中已知的传统和创新的蛋白 A 配体能够通过共价或非共价技术固定。随后，可以将蛋白 A 功能化的 MP 直接添加到细胞液或细胞培养上清液中。

       在这里，第二个有用的特性开始发挥作用：如前所述，与传统色谱填料相比，它们的孔隙率降低或几乎可以忽略不计。基于此工作原理提出了几个案例研究，尽管方法略有不同。

4. 澄清和捕获的整合可产生高纯度

       在实践中，将蛋白 A 功能化的 MP 直接添加到细胞培养液中。正如 Brechmann 等人使用蛋白 A 的琼脂糖 MPs。10 所示，即使是高达 100 x 10⁶ 个细胞密度也不会对结合或洗脱行为产生不利影响。10, 11 纯化约 16 L CHO 细胞培养物，滴度在 1.3~1.5 g⁻¹ IgG 之间， 花了 5 ~8 个小时。因此，颗粒上结合位点的饱和在孵育后 1 小时内完成。通过集成处理，他们在洗脱液中实现了非常低的宿主细胞蛋白 （HCP） 水平 （< 5 ppm），他们将其归因于温和的处理，没有明显的细胞裂解11。

       Ebeler 等人使用德国 Andritz KMPT GmbH 的符合 GMP 标准的转子-定子高梯度磁选机 （RS-HGMS） 系统 MES 100 RS 证明了从细胞培养物中直接捕获 mAb。12 他们报告称，每毫升应用填料的工艺生产率是传统色谱法的 3 倍，这凸显了磁性分离技术的巨大潜力。

5. 缺点和瓶颈

       使用琼脂糖包被 MP 的工艺可以与色谱工艺竞争，但受到其孔隙率导致的相当缓慢的动力学的限制。开发低孔隙率的磁性介质非常重要。为了解决这个问题，我们小组开发了一种基于非功能化和非多孔 MP 的替代颗粒方法（http://www.purimagbead.com/Product/Proteinextract/），具有肽标签促进的亲和配体固定。13 该方法无需耗时且昂贵的颗粒包被，减少了化学品消耗，并能够在几分钟内实现快速的 IgG 相互作用。

       用于 mAb 分离的常规 MP 的另一个缺点是需要酸性 pH 条件，这可能对 mAb 产品有害。我们通过将工程化钙依赖性蛋白 A 配体共价偶联到 GPTMS 功能化 14，该策略提供了由大部分无孔颗粒引起的更快动力学，并能够在 pH 5.5 左右实现温和的洗脱条件。

       然而，需要解决的主要挑战是低浓度因子和缺乏合适的大型分离器系统。例如，假设每个循环处理 25 g mAb，则以 5 g ^-1 的 mAb 滴度（总共 10 kg）处理 2,000 L 生物反应器的上清液，大约需要 400 次批次运行。15 即使循环时间短至 1 到 2 小时，纯粹的运行次数也存在瓶颈，这主要是由于当前磁选机的过滤能力有限。针对此问题，提出了两种策略。

       首先，基于磁分离的工艺可以很好地整合，以至于可以跳过澄清和过滤步骤。这样节省的时间可以补偿一些高循环数。

       其次，开发颗粒容量为几百克到几千克的大型磁选机至关重要。首先，Andritz KMPT GmbH 提供了带有 10 L 腔室的 RS-HGMS，理论上可以将循环次数减少到大约 40 次。正如 Tesanovic 等人最近所描述的，结合磁选机多尺度模型的开发，16 放大将变得更加直接。基于这些模型，腔室和矩阵设计可以进行计算机优化并相应地进行调整。还应考虑到，随着颗粒浓度的增加，洗脱可以产生更高的潜在产物浓度，因此实施额外的更小的洗脱室可能是有希望的，正如 Brechmann 等人所报告的那样10。结合改进的分离器设计，应以连续或半连续处理为目标，例如，通过分离器的串联或磁力离心。半连续或完全连续处理可能会显著提高生产率，就像传统色谱一样。17

6. 新模式的纯化

       虽然 mAb 工艺受益于已建立的平台，但基于病毒的治疗、质粒、基于 RNA 的疗法和 CAR T 细胞疗法等新模式仍处于开发的早期阶段。纯化这些分子的复杂性往往受到低生产率的阻碍，这推高了成本并延迟了市场准备。18 这些新模式的工艺开发仍处于起步阶段。这使得现在成为在工艺开发中实施磁性分离的理想时机，以便于以后在符合 GMP 的工艺中实施。

       Turco 等人使用 RS-HGMS （Andritz KMPT GmbH） 系统从粗HEK293T细胞裂解物中纯化了重组腺相关病毒 （rAAV），其中 Mag Sepharose 微珠由 rAAV 特异性配体功能化。与基于色谱的处理相比，他们的工艺实现了 63% 的回收率，显著减少了 HCP 和 DNA，同时将生产率提高了 10 倍。18

磁性分离是一种成熟的分析规模 DNA 纯化方法。因此，它也被研究用于 mRNA 的大规模纯化也就不足为奇了，尤其是关于基于 mRNA 的疫苗的潜力。

       在 3D 打印的一次性磁性分离室中使用用 oligo （dT） 功能化的磁珠，为生物制药应用提供了一种有趣的方法。19 虽然缺乏大规模实例，但正如 Harrer 等人最近提出的那样，磁性分离可能有望用于 CAR T 细胞的纯化。20 由于这些分子中的大多数需要轻柔处理，因此必须研究颗粒引起的物理应力的影响。因此，目前尚不清楚开发的大型磁选机是否可以在不进一步修改的情况下用于处理新模式。正如已经描述的 mAb 工艺纯化一样，缺乏大型磁选机是进一步生产规模工艺实施的瓶颈。

7. 重组蛋白的纯化

       从微生物裂解物、发酵液或血清中纯化生物制药蛋白质与上述用例不同，因为它们通常涉及低价分子。因此，没有配体或官能团化的简单 MP 是降低成本的理想选择。在这里，分离产量和纯度可以通过正确选择表面积与生物量比来调整。最后，它仍然是特异性和成本效益之间的赌博。

       当使用非功能化 MP 时，与目标蛋白质融合的短亲和肽标签可用于实现一定的特异性。其结果是一种基于成本极低、无毒 MP 的工艺，具有高结合载量，但与功能化 MP 相比特异性较低。21

       我们相信，它们用于用感兴趣的细胞外产物从发酵液中原位去除产物的应用具有巨大的潜力。带有固定化金属离子（如 Cu2+）的 MP 是特异性更高且材料成本仍然较低的不错选择。22 这种方法结合了色谱中常用 （His）6-标签的优点和磁性分离的优点。值得一提的是，色谱处理的专有技术可以广泛应用于调整磁性分离，因为两者都是基于吸附的单一作。在这里，磁分离的研究和技术开发程度较低，但具有设计灵活性和无传质限制的优势。

       文献中使用低成本或非功能化 MP 纯化蛋白质的大规模工艺揭示了与参比色谱工艺相当的产量和纯度。同样，它们的主要优点是显著缩短了处理时间，尤其是在可以省略离心或过滤步骤的情况下。然而，与 mAb 加工相同的缺点仍然存在。缺少大规模装置的方面是重组蛋白回收更加严重，因为这些分子通常以更高的体积生产，进一步增加了使用目前市场上可用的小型装置所需的循环次数。

8. 未来展望

       生物制药生产非常严格，与传统层析一样，在狭窄的窗口内需要微调和优化的参数。因此，预计未来的改进有限，真正的过程强化需要颠覆性技术——正如我们上面所展示的，磁分离技术具有巨大的潜力。然而，该技术需要进一步发展，因为市售的批量分离器会严重限制吞吐量和可实现的浓缩因子。在我们看来，具有增强颗粒容量和（半）连续磁分离模式的分离器是提高通量和生产率的关键，因此应该成为未来研发的重点。

       我们小组已经致力于过程分析技术 （PAT） 的实施和实时过程控制的建模方法的开发，这对连续应用起决定性作用。16 此外，开发新型和更高效的功能性颗粒应该是另一个研究重点，因为这些颗粒显着影响磁分离过程的适用性和生产率。厦门普睿迈格生物科技有限公司（www.purimagbead.com）致力于各种功能的磁性纳米颗粒的制备，并形成了丰富的研发经验和产品。通过自动集成 MP 合成及其在生物分离应用中的应用来高效生产这些颗粒，以降低成本并全面提高工艺生产率。最后，我们想解决生物制药行业中的一次性设备趋势，正如 Wommer 等人所展示的那样，可以通过磁分离室中的一次性入口来实现这一点。在我们看来，磁分离技术的三个最具决定性的优势是

1. 由于显著减少的传质限制和高结合载量，大量靶分子与磁性颗粒的快速相互作用，
2. 集成离心、过滤和澄清步骤的能力，可实现高水平的工艺集成，以及
3. 裸磁颗粒的成本效益高且简单的大规模合成。

       然而，我们知道磁分离仍处于起步阶段，新技术要在严格监管的生物制药行业中获得认可并与现有技术竞争是一项挑战。尽管如此，我们相信磁分离提供了一种有价值的方法，可以为提高整体生产率、增强可持续性、简化加工和节省时间铺平道路。

编者注：Galbusera 和 Zimmermann 的贡献相同。

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