在生物交联领域，除了EDC-NHSS偶联工艺外，最常见的还属巯基（-SH）修饰工艺。EDC-NHSS偶联工艺虽然能够解决大多数生物质材料的功能化，但选择性弱于-SH修饰工艺。蛋白质内大量的-NH2或-COOH使得EDC-NHSS偶联事件存在大量的随机性。受限于空间位阻效应，若修饰位点的-NH2或-COOH刚好封闭了蛋白的功能区（如抗体的结合区、酶的活性位点），会使偶联后蛋白的活性降低。而巯基偶联的选择性则更优，在氨基酸中，与半胱氨酸（图1）表现出优异的选择性，在选择性修饰上更具优势。

图1. 半胱氨酸

       巯基偶联过程主要应用于巯基与马来酰亚胺、巯基与巯基/二硫化合物或巯基与卤代乙酰基，具体反应如下图2所示。巯基反应表现出更高的反应活性，一般无需额外的反应助剂。但活性高的弊端表现为，富巯基官能团的分子趋向于分子内的反应，容易被液体环境中的溶解氧或金属离子（如铜离子）（巯基化合物同时是常见的还原剂，如半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)等）催化形成二硫键。例如，富含巯基的A物质（HS-A），可能在运输或保存过程中，发生分子内的偶联反应，生成（A-S-S-A）。为了应对该种情况，往往需要在巯基偶联反应前，加入更强的还原剂，如TCEP/DTT等，将A-S-S-A还原为单体HS-A的状态。

图2. 巯基偶联工艺(a)马来酰亚胺与巯基反应(b)二硫化合物与巯基反应(c)氯代乙酰基与巯基反应[1]

       此外，巯基还表现出与贵金属间的超强结合力，在无机材料-有机材料功能化方面，具有广泛的应用。巯基和贵金属，如金、银、铂等材料的纳米簇、纳米颗粒、纳米锥、纳米棒、纳米线、电极等均有报导。

       基于以上两种偶联现象，本文对巯基偶联过程给出如下参考：

       1.巯基与巯基反应性官能团偶联过程：

       (1)巯基偶联推荐pH环境为7.0-8.1，常用磷酸盐缓冲体系即可。将1-10mg反应物加入10mM磷酸钠，150mM氯化钠的反应体系中，pH = 7.4。

对于一些二硫键包埋在生物质分子内部的情况，则需要额外增加变性剂或解离剂使蛋白或DNA暴露出内部的巯基位点，如尿素(8M)、SDS(2.3% (w/w))等。加入10mM的EDTA有助于维持还原后巯基的活性。

       (2)加入1-10mM的DTT(轻微臭味)或20mM的TCEP，室温反应2h。考虑到实验目的的差异，对于蛋白类产品，若无需保持活性或对于热稳定性优的蛋白质，可通过加热来提高反应速度，如50℃ 30min。对于DNA类产品，加热对DNA反应活性影响不大，且更有利于DNA反应链段展开，加快过程反应速率。

       (3)通过凝胶分离移除多余的DTT分子，体系中加入EDTA(螯合金属离子)有助于保持巯基单体的反应活性。或透过选择不同分子量的透析膜透析/超滤离心膜过滤（建议使用PBS缓冲体系+10mM EDTA透析或过滤）。

       (4)分离结束后，快速加入过量比例的待反应物(含马来酰亚胺、巯基等活性官能团，摩尔比：1-10，根据结合实际情况增加比例)，室温反应2h，加热可适当缩短反应时间。

       2.巯基与贵金属偶联过程：

图3. 金属与巯基化合物的反应

       金属表面与巯基的反应如上图3所示，属于一种配位作用。在该过程中，形成配位键的电子由S原子的孤对电子单独提供，意味着二硫化合物同样可能与金属直接反应。考虑到贵金属材料的多样性，以下仅以纳米金为例给出参考。

       金属与巯基化合物的反应，如巯基DNA或蛋白，首先需要考虑纳米颗粒制备过程中的保护剂，尤其是柠檬酸/CTAB/CTAC/SDS。考虑到纳米金颗粒制备过程中和分散过程中需要表面活性剂维持其分散状态，过量的表面活性剂封闭了纳米金的Au反应位点，导致巯基化合物很难进攻纳米金形成金硫键。因此，反应之前，应该在维持纳米金分散的同时尽可能降低表面活性剂的含量，将该状态下的纳米金尽快与巯基化合物反应。巯基化合物与纳米金形成金硫键后，又反过来赋予了纳米金较好的分散性(在纳米金表面形成了一层保护层)。所以，一个很好验证纳米金是否与巯基化合物反应的方法是，反应结束后，离心分离的纳米金颗粒依然保持较好的分散性，而非聚沉(聚沉一般意味着反应失败)。此外，可通过碳骨架(-[CH2]n-)延长其末端的巯基官能团，如HS-[CH2]₁₂-R增强巯基的进攻能力。或可以通过双齿硫醇配体(如硫辛酸衍生物)增加反应活性。

       此外，电负性也是需要考察的重要因素。结合zeta电位仪分析出的纳米颗粒的电荷状态，纳米金合成工艺下（柠檬酸体系），其表面更容易带负电，这意味正电位的生物质更容易进攻纳米金（消除电荷排查作用）。因此，降低反应的pH值，一方面可降低纳米金表面的带电量，另一方面，可以使生物质更倾向于带正电(结合等电点pI)，该类方法在一些纳米金修饰工艺中较为常见[2]。通过盐老化的方式也是常见的技术路线，通过加入高浓度的离子盐同样可以降低带有负电荷（如DNA单链）的生物质的电荷，降低静电排斥作用，实现巯基生物质的修饰，以下简要介绍盐老化的实验思路[3]：

       (1)利用适量的DTT或TCEP将带修饰的巯基生物质还原为SH单体，尽管二硫键同样可以与纳米金反应，但S-S一般封闭在生物质的中间位置，很难快速高效地进攻纳米金颗粒，表现出低反应速率。考虑到生物质的低浓度，一些实验过程中为了简化步骤，不会进行提纯操作。针对该种情况，DTT和TCEP的添加量不宜太高，适当的DTT和TCEP有助于二硫键生物质还原成单体，过量的DTT和TCEP能够将形成Au-S的生物质解离。一般添加量可以按照反应物的1-10倍量适当添加，若反应活性很低，可适当增加DTT和TCEP的比例。以下考虑去除DTT和TCEP的情况：将巯基修饰的单链DNA加入10mM磷酸钠，150mM氯化钠的反应体系中，pH = 7.4。加入10mM的DTT，室温反应2h后，利用色谱柱纯化，将形成二硫键的单链DNA还原为巯基末端的单链DNA。

       (2)将巯基末端的DNA单链加入分散在10mM PB和0.01% SDS纳米金溶液中，推荐DNA浓度为1OD/mL(约5-10nM)，室温孵育20min。

       (3)将10mM PB，2M NaCl，0.01% SDS母液逐步加入上述混合溶液中，提高盐离子浓度至50mM，随后超声10s，继续孵育20min。

       (4)重复(3)过程，逐步将反应体系中的盐离子浓度提高至100mM，200mM，300mM直至1M，随后室温反应过夜(盐离子浓度一定要逐步增加，若盐离子浓度快速提高可能会导致纳米颗粒聚沉)。

       (5)离心分离，去除上清液，将离心得到的纳米颗粒分散在10mM PB和0.01% SDS的分散液中。

       除了盐老化的实验方法外，另一篇报道中的实验方案表现出更高的反应效率和更简单的操作步骤，具体为冻融-解冻的实验步骤[4]。

       (1)将3uL 100 uM的巯基DNA加入100uL 10nM(HEPES缓冲液，pH=7.4)的纳米金颗粒中，该步骤无需加入TCEP或DTT。

       (2)将上述混合物加入冰箱冷冻层(-20℃)，冷冻2h。在逐渐冷冻的过程中，纳米金和DNA在溶液中的浓度逐渐富集到极高的浓度，这种高浓度加速了巯基DNA和纳米金的反应。

       (3)从冰箱中取出，解冻，离心分离，得到产物。

       如何辨别单链DNA是否有效修饰在纳米金颗粒表面？可通过以下途径：

       (1)外观上实验失败表现为明显的聚沉，颗粒颜色偏蓝黑。实验成功，溶液应表现为淡紫红色；

       (2)紫外吸收光谱中变现为最大吸收峰红移1-2nm；

       (3)Zeta电位发生变化；

       (4)DLS表征应能观察到纳米粒子水合半径增大；

       作为生物交联中常见的修饰工艺，巯基偶联相较EDC-NHSS偶联表现出更优的选择性，且更加生物友好(无需苛刻的环境，更能有效保护生物质的活性)。

参考文献：

[1] David Wild. The Immunoassay Handbook Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques, Fourth Edition, 2013.

[2] Zhang, X.; Servos, M. R.; Liu, J. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7266.