磁珠法RNA pull-down 的经典操作流程

来源:生物磁珠专家 2018-12-22 11:37:29      点击:

采用链霉亲和素磁珠(PuriMag G-strep 货号PMG015)进行RNA pull-down 

RNA pull-down assay using Streptavidin magnetic beads 


1. RNA pull-down 第一天——生物素探针标记RNA

1)前期准备:取出Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit,将试剂盒中的PEG及DMSO置于常温,其余组分置于冰上融化,也可将PEG放于37摄氏度融化;打开PCR仪;

2)依照RNA母管含量,用DEPC水溶解RNA,我们通常是10ug/管,用10μl DEPC水溶解。同时溶解试剂盒中Control RNA作为阴性对照;

3)取对照RNA及目标RNA各5 μl,放于200 μl的PCR管中,每管可加1 μl DMSO,混匀后置于PCR仪上,85℃,5min,然后立即置于冰上5min;(DMSO的加入可有助于打开RNA的二级结构,提高RNA ligation的效率)

4)按照下表配制探针标记反应的体系:

成分                                                  体积(μl)    

water                                                         3
10X RNA ligase recation buffer                      3
RNase inhibitor                                           1
Non-labeled RNA                                         5

Biotinylated Cytidine Bisphosphate                1
T4 RNA Ligase                                            2
PEG 30%                                                  15
Total                                                        30

5)混匀上述反应体系,之后放至PCR仪内, 16℃,4h至过夜。反应时间的延长可提高连接效率;

6)连接反应结束后,向每管加400μl nuclease free-water;

7)每管加300 μl酚氯仿提取标记成功的RNA;涡旋后最大转速离心15min,小心将上层水相移取到新的EP管中;

8)加10 μl 5M NaCl ,2 μl糖原,以及600 μl 预冷的100%乙醇,放于-20℃或-80℃沉淀,可沉淀过夜。


2. RNA pull-down 第二天


1)前期准备

·DTT ,蛋白三联室温溶解;
·streptavidin magnetic beads;(PuriMag G-strep磁珠)
·RNase Inhibitor;
·细胞,10cm大皿若干,长至约80~90%密度;

2)RNA抽提

a)将沉淀过夜的RNA取出,4℃,最大转速离心30min,离心后可见管底的白色沉淀,及为RNA;

b)小心移取上清,用1ml 70%乙醇洗涤,8000rpm 离心10min,之后吸净管内液体,空气中晾干RNA,若乙醇未挥发完全,将影响下游实验效率;

c)每管加20 μl nuclease free-water溶解RNA,之后将RNA放于PCR仪中,95℃,5min使其变性,之后立即置于冰上,备用。

3)细胞裂解

a)弃去培养基,用预冷的PBS洗3次,吸去上清;

b)每个大皿中加入200μl cell lysis buffer A (加蛋白三联);

c)用细胞刮刀刮下细胞,收集至EP管,液氮中三冻三融;

d)离心,4℃,3000rpm,离心10min;

e)转移上清至新的EP管中,置于冰上;可加200U/ml RNase Inhibitor;

f)取10-20 μl左右上清至新管中,作为实验input组。


4)magnetic beads (PuriMag G-strep 货号PMG015预处理

a)涡旋混匀beads;

b)每管取400μl beads(如本次实验中,control RNA 及目的RNA各1管),置于磁力架上,吸去上清;

c)用800μl 1X binding & washing buffer ,洗3次,吸去上清;


5)RNA 与beads结合

a)向上一步的beads中加入400μl 2X binding & washing buffer;

b)向上一步中加入20μl RNA ,再补380μl DEPC水,使其终体积为800μl;

c)室温慢速旋转20min,使beads与RNA充分结合;

d)将上一步的管子置于磁力架上,吸去上清;

e)用800μl 1X binding & washing buffer(含RNase Inhibitor, 1U/ μl),洗3次,吸去上清;

f)用cell lysis buffer A 洗一次beads, 吸去上清,注意不要让beads干掉。


6)RNA与蛋白相互作用

a)向上一步已处理好的beads中每管加入500μl 细胞裂解液(第3步);同时向每管加入RNase Inhibitor, 1U/ μl;

b)4℃慢速旋转2h,使beads与细胞裂解液充分结合;

c)磁力架上吸去上清,用400 μl新鲜配制的cell lysis buffer A(+RNase Inhibitor+蛋白三联),洗5次beads;

d)吸去上清,用25μl预冷的0.1% SDS溶液重悬beads,加6.25μl 的5X蛋白上样缓冲液,100℃金属浴煮10min.之后立即置于冰上5min,再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中,准备蛋白上样。


7)蛋白的检测

可采用western blot 或质谱继续下游蛋白的验证。

以上就是的RNA pull-down技术的超详细秘籍啦!


用于pull-down的链霉亲和素磁珠请参考:

 http://www.purimagbead.com/Product/8271042221.html (200nm链霉亲和素磁珠)

http://www.purimagbead.com/Product/9728163513.html (1um链霉亲和素磁珠)