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货号
规格
MS-TRP001
1 ml
MS-TRP010
10 ml
1. 产品描述
固定化胰蛋白酶MagStart-Trypsin是一种磁性聚合物微粒上的Trypsin。MagStart-Trypsin技术有别于传统的固体或裂解珠技术，因为它提供了一个超多孔聚合物网络，允许蛋白质渗透到整个微颗粒的体积中。这样就能多点共价连接Trypsin等蛋白质的多点共价附着，稳定酶在非标准条件下的应用，并防止自溶。MagStart-Trypsin可实现快速有效的蛋白质消解。
固定化胰蛋白酶MagStart-Trypsin设计目的是提高质谱分析产生的实验数据的质量。磁性微粒允许在磁处理平台实现样品消化自动化，从而提高通量和实验一致性。固定化蛋白水解酶的主要特点是可以增加样品覆盖深度，因为酶可在 MS 分析前去除。 固定化提高了酶在非标准实验条件下的稳定性，如有机溶剂和离液盐的存在，从而提高蛋白质组学工作流程的通用性。磁微粒的胰蛋白酶含量高，可缩短方案时间。消化时间仅为 1 小时，达到通常只有 24 小时胰蛋白酶消化才能达到的数据质量。此外，微颗粒的可压缩性还减少了洗涤和洗脱过程中微颗粒之间的间隙，从而提高了这些步骤的效率。使用磁分离器，MagStart-Trypsin可快速分离（<20 秒）。竞争对手的微粒则需要长达 4 分钟的时间才能分离。
MagStart-Trypsin优势
益处
高Trypsin载量
高效消解 <60 min；
增加难消解蛋白消解效率；
降低反应体系体积；
在变性剂存在下消解
增加难消解蛋白的消解效率；
减少Trypsin的自消解
移除消解酶提高数据质量；
快速磁分离
方便高效移除Trypsin；
高通量；自动化；
抗氧化
减少样品污染物；
延长货架期。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Protein digestion, proteomics, mass spectrometry, sample preparation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functionality
Trypsin
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
15 mg/ml in 100 mM acetic acid
Stability
pH 8.0, 37 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
2. 样品准备、MagStart-Trypsin的平衡和消化
有几个因素会影响胰蛋白酶消化的效率。这些因素包括样品制备、缓冲液成分和 pH 值、污染物或干扰化合物的存在以及消化温度。MagStart-Trypsin可提高覆盖率，改善难消化蛋白质的裂解。如没达到最佳性能，请参阅下面的推荐样品制备/平衡/消化程序以及《常见问题》（第 3 节）。
注意：所有试剂均应新配并达分析级，以确保最佳性能。下文所述缓冲液仅作示例，并不具限制性。
2.1. 样品制备
为确保最佳消化，目标蛋白需变性、还原和乙酰化。
1) 将样品悬浮在含6–8 M 尿素的Tris缓冲液中（50 mM，pH 8.0）。
2) 加二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为10 mM。
3) 室温孵育 1 h。
4) 加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度为 30 mM。
5) 黑暗环境下孵育45 min。
6) 用Tris缓冲液（50 mM，pH 8.0）稀释或透析样品至尿素浓度 ≤1 M。
注意：固定化酶具有防止变性的稳定性，酶可能适合在非标准条件下使用，如增加离液盐的浓度（尽管活性会降低）。
2.2. MagStart-Trypsin的平衡
MagStart-Trypsin以15 mg/ml的悬浮在 100 mM 乙酸中。运输时 磁微粒在消化缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0）中平衡。按以下步骤平衡足够数量的微粒以进行消化反应 如下所述：
1) 涡旋或倒转重悬 MagStart-Trypsin胰蛋白酶，以确保悬浮液均匀。
2) 将 20 µl的MagStart-Trypsin转移到一新试管中（20 µl的MagStart-Trypsin足以在60min内pH 8.0 的 50 mM Tris 溶液中消化 ~50 µg 总蛋白）。
注意：（1）起始蛋白量少于50 µg时，微粒的数量可减少到最少 5 µl，保持微粒与蛋白的比例。（2）在变性条件下（即 2-6M 尿素或高达 0.5% SDS）消化时，将微粒量至少增加到 60µl，消化时间至少增加到37°C下2 h。
3) 磁分离至澄清。
4) 吸除上清液。
5) 用移液管轻轻将MagStart-Trypsin再悬浮于 50 µl 的 Tris（50 mM, pH 8.0）中。
6) 将试管放在磁性分离器上，回收磁微粒。
7) 吸除上清液。
8） 重复步骤5~7。
9） 吸除上清液后，MagStart-Trypsin。
2.3. 蛋白消化流程
1) 将在消化缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0）中预平衡过的蛋白质样品加入2.2的MagStart-Trypsin。
2) 使用 50 mM Tris 将总反应体积调至 50 µl。
3) 在 37°C 下用涡旋或合适的微离心管混匀器将样品孵育 60 min，以确保MagStart-Trypsin在消化过程中保持悬浮状态。由于样品量较少，不建议倒置混合。
4) 如上所述，磁回收微粒。
5) 将上清液（消化肽）转移到新离心管中。
6) 向微颗粒中加入50 µl 的5 M NH4OH。
7) 在室温条件下，用涡旋或合适的微离心管混匀器将样品孵育20 min，洗脱过程中保持悬浮状态。由于样品量较少，不建议倒置混合。
8) 将离心管放在磁分离器上至澄清。
9) 将上清液（洗脱肽）转移到装有剩余消化肽的微离心管中（步骤 2.3.5）。
10) 向汇集的多肽中加入甲酸，至最终浓度为 0.5%。
注意：在使用低量起始蛋白质（少于 20 µg）时，建议通过冻干或真空干燥减少 体积。
11) 使用 C18 柱子或其它合适方法对样品脱盐。
12) 进行质谱分析。
注意：如果蛋白质数量允许，可使用 SDS-PAGE 评估蛋白质消化的效率。
3. 常见问题
问题
可能原因
改善方法
不完全消化
消化pH不对
确保消解pH=8.0
消解温度
确保消解温度为37 °C
目标蛋白的消解位点不可及
在更高温度（如55 °C）消解或重新评估高离液盐消解条件（如 2-5 M尿素）
初始蛋白中含干扰物
在推荐消解缓冲液中稀释或透析除去污染物
初始蛋白量不对
采用其它蛋白定量方法
消化时间不足
增加消解时间至4-6 h
低的序列覆盖率或低的质谱信号
最终洗脱肽中含干扰化合物
将洗脱下来的肽段进行脱盐
蛋白/微粒比例不合适
维持30µl 磁颗粒对50µg蛋白，方案可调整至最小5µl 磁颗粒对~10µg蛋白
本磁珠仅供科研使用！
