货号
产品名称
包装
PMG-ConA001
PuriMag™ Con A Magnetic Beads （伴刀豆球蛋白A磁珠）
1mL×1
PMG-ConA005
5mL×1
保存条件： 4ºC保存，两年有效。
一．产品简介
² PuriMag™ Concanavalin A Magnetic Beads，也称Concanavalin A磁珠、ConA磁珠、刀豆素A磁珠、刀豆凝集素磁珠、伴刀豆球蛋白A磁珠，由高质量的刀豆素A（Concanavalin A, ConA）与超顺磁性纳米磁珠共价偶联而成，能够快速、高效、灵敏、特异性地与糖蛋白、糖脂、多糖等带有糖基化修饰分子结合。
² Concanavalin A，简称ConA或Con A，中文名为刀豆素A，又叫伴刀豆球蛋白A、刀豆蛋白A或刀豆凝集素A，是一种从Jack beans（Canavalia ensiformis）分离的甘露糖/葡萄糖结合凝集素，是使用最广泛的凝集素之一，CAS号为11028-71-0，其单体的分子量约为25.5kDa，可结合一个Ca2+和一个Mn2+，含一个糖基结合部位，对末端α-D-甘露糖基和α-D-葡糖基残基具高亲和力。刀豆素A是一种T细胞有丝分裂原，可激活免疫系统，募集淋巴细胞并诱导细胞因子的产生。除了促有丝分裂活性外，刀豆素A还可通过特定分子机制诱导程序性细胞死亡。据报道刀豆素A还可激活NFAT（Nuclear factor of activated T cells），而NFAT是转录因子家族，在免疫系统的发育和发挥免疫功能中起重要作用。当pH在5.8~7.0之间时，刀豆素A以四聚体形式存在，在pH6.5或更低的条件下解离为二聚体，pH高于7.0时可形成更大的聚合体。
² 本产品对糖类具高度专一识别能力，可特异性结合糖类，用于分离细胞、细胞核或糖蛋白等含有适当糖基化修饰的分子，可直接用于CUT&RUN（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）等实验，获得的糖基化蛋白可用于Western、质谱等的分析检测。
² 本产品对糖类蛋白的结合量高，而且磁珠粒径小，不易产生非特异吸附。本产品每毫升磁悬液含有≥1mg ConA，每个ConA蛋白具有4个糖基结合部位，每毫升磁悬液可结合≥1mg糖蛋白，可高效地进行细胞或糖蛋白等的分离纯化等实验。
² 本产品所使用的纳米级磁珠具有超大比表面积，有效缩短了ConA与糖类结合所需的时间，避免在长时间操作过程中糖蛋白的降解，有效保证了糖蛋白的活性及完整性。
² 本产品储存在特殊保护液中，不含甘油，磁分离，无需离心。本产品不仅适用于少量样本的检测，也适用于高通量筛选的自动化操作系统，不同操作方法之间一致性高。
二．主要技术指标
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled protein
Concanavalin A
Isotype
IgG2b
M.W. of antibody
~102kDa (tetramer)
Protein concentration
≥ 1mg Concanavalin A per ml beads
Binding capacity
≥ 1mg glycan/glycoproteins per ml beads
Specificity
Glycan and glycoconjugates
Application
Isolating cells or glycoproteins, CUT&RUN
三．注意事项
l 本产品需维持pH 6-8，避免高速离心、干燥或冻存。
l 本产品使用前要颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免ConA变性。
l 用于沉淀或纯化时，建议设置适当的阳性和阴性对照组。
l 待结合分子的类型、大小等都会影响结合效率，建议通过稀释法确定每种具体应用的磁珠用量，同时可考虑加大磁珠用量至待结合分子2-3倍摩尔量以确保结合充分。
l ConA需要Ca2+和Mn2+存在才能有活性，实验过程应避免使用含EDTA或其它金属离子螯合剂的试剂。
l 糖蛋白样品收集后宜尽快完成纯化，并应始终置于4ºC或冰浴，以减缓糖蛋白降解。为有效抑制蛋白降解，可在蛋白样品中添加适量蛋白酶抑制剂混合物，但各个蛋白酶抑制剂混合物中的EDTA不能添加。
l 与细胞孵育时ConA磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。
四．使用说明
以下以纯化糖蛋白或分离细胞为例，CUT&RUN实验需按照CUT&RUN的实验方法准备细胞和后续实验。
1. 缓冲液的准备
Binding Buffer：20mM Hepes(pH7.4), 150mM NaCl (optional), 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2;
Wash Buffer：20mM Hepes(pH7.4), 150mM NaCl (optional), 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2, 0.1% Tween-20;
Elution Buffer：5mM Tris(pH8.0), 150mM NaCl, 1M Glucose;
注1：使用PBS缓冲液可能会产生沉淀，建议使用Hepes缓冲液。使用前，所有溶液平衡至室温。Binding Buffer和Wash Buffer中的150mM NaCl都是可以选择性添加的，如果用于CUT&RUN等对于细胞活力关系不大的实验，不推荐添加150mM NaCl；如果分离获得的细胞后续用于细胞培养或细胞功能研究，建议添加150mM NaCl。不添加150mM NaCl时细胞结合和沉淀的效率更高，添加150mMNaCl时能更好维持细胞的渗透压，使细胞处于更好的状态。
注2：Elution Buffer需要根据糖蛋白的类型或糖蛋白与ConA磁珠的结合程度进行一定的优化。
注3：由于细胞与ConA磁珠结合的非常紧密，分离的细胞不建议使用本洗脱液进行洗脱。
2. 样品的准备（其中细胞以哺乳动物细胞为例）
a. 对于贴壁细胞：去除培养液，用20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl洗涤细胞两遍。按照6孔板每孔100-200μl胰酶的比例加入胰酶消化细胞。1-2分钟后，加入20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl重悬洗涤，400-500×g室温离心5分钟收集细胞。
b. 对于悬浮细胞：400-500×g室温离心5分钟收集细胞，吸除细胞培养液，然后用20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl重悬洗涤，400-500×g室温离心5分钟收集细胞。
c. 细胞样品的重悬：上述细胞样品去除上清后，加入适量Binding Buffer重悬一次，取少量细胞悬液在显微镜下计数。每个样品的细胞数为10,000-100,000，体积为500μl。根据计数计算每个样品所需细胞悬液的体积，并用Binding Buffer对细胞悬液进行稀释。
d. 对于细胞或组织裂解液或血清样品：用Binding Buffer根据实际进行一定的稀释调整。
3. ConA磁珠准备
a. 洗涤。由于ConA磁珠储存在保护液中，使用前用适量10倍体积的Binding Buffer洗涤2次。
(a) 用移液器轻轻吹打重悬ConA磁珠，按照每200-500μl样品使用10μl ConA磁珠悬浊液的比例，取适量ConA磁珠至一洁净离心管中，加入10倍体积的Binding Buffer。
(b) 用移液器轻轻吹打重悬ConA磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述洗涤步骤一次。
b. 活化。按照ConA磁珠初始体积的量，用Binding Buffer重悬ConA磁珠。
注1：多个样品时，取总磁珠量，合并洗涤处理后再平分到各个样品中。
注2：活化好的磁珠应当天使用。
4. 样品的结合、磁分离和洗涤
a. 孵育。加入适量样品，用移液器重悬磁珠，置于旋转混合仪上，室温孵育10-30分钟或4ºC孵育4-16小时。
注1：孵育过程中，若ConA磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
注2：为了保证样品完全结合到磁珠上，可加大ConA磁珠用量，并延长孵育时间。
b. 磁分离。将离心管置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
c. 洗涤。取0.5ml的Wash Buffer加入分离得到的磁珠中，用移液器轻轻吹打重悬磁珠，置于旋转混合仪上洗涤5分钟。将离心管置于磁力架上分离1分钟，去除上清。重复洗涤3-4次。
5. 糖蛋白的洗脱
a. 每个样品加入50-250μl Elution Buffer，混匀后置于旋转混合仪上，室温孵育10-30分钟。如果洗脱效果不佳，可重复洗脱一次，合并两次洗脱液，或者增加孵育时间。
b. 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，所得上清为通过ConA磁珠分类纯化获得的糖蛋白。
c. 如果用于SDS-PAGE电泳或Western检测，建议加入适量5×SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟，然后置于磁力架上分离10秒，取上清进行后续检测。
注1：需根据糖蛋白的类型或糖蛋白与ConA磁珠的结合程度对洗脱液进行一定的优化，或使用PNGase F酶进行糖基的切除，从而使糖蛋白从磁珠上解离下来。
6. 细胞的洗脱
对于细胞，由于磁珠较小，基本不会对细胞造成机械性压力，不影响细胞的生长和活性，理论上可不洗脱。
本产品仅供科研使用！
