1. 概述
PuriMagTM G-Hydrazide酰肼活化磁性纳米微粒是均一的、聚合物包覆的超顺磁纳米粒，亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性、低非特异吸附和易操作性，表面涂有高密度的酰肼官能团官能团。它通过形成稳定的共价键，广泛用于定点固定含醛或酮的配体，例如抗体、凝集素、糖蛋白和碳水化合物。 PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠可用于通过氧化糖基团获得醛基从而固定糖蛋白。它是固定多克隆抗体的理想选择，多克隆抗体包含位于分子Fc部分的大量碳水化合物。由于此类抗体仅通过Fc部分与磁珠偶联，因此它们的抗原结合位点不受阻碍，可以正确定向，从而提供了更高的纯化能力。如果某些单克隆抗体包含足够量的碳水化合物，则可以使用酰肼磁珠固定化。
固定化化学使高碘酸钠氧化多糖部分糖基中的顺式乙二醇基团。然后，生成的醛与磁珠上的酰肼基自发反应，形成稳定的共价键。偶联条件在时间和温度方面是灵活的。长的间隔臂减少了空间位阻，并且支持物具有最小的非特异性结合特性，这使其成为用于亲和色谱的极佳磁珠。
特点和优点：
w 共价高效配对；
w 稳定的共价键和低水平的配体泄漏；
w 产生可重复使用的免疫亲和基质；
w 低特异性结合；
w 固定1~20 mg蛋白质或0.1~2mg肽/ 磁珠；
磁珠偶联基本原理：
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Hydrazide groups
Group density
~300 µmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in in 1M NaCl and 0.02% NaN3
Stability
pH 3.5~10, 4~50 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：以下方案是将蛋白或多肽与PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠偶联的示例。强烈建议进行滴定，以优化用于每种单独应用的磁珠量。该协议可相应地按比例放大和缩小。应避免使用含有伯胺或糖的Tris或其他缓冲液，因为它们会与预期的偶联反应竞争。
A. 所需材料
1）磁力架（用于手动操作）：用于容纳12个单独的1.5~2ml离心管（Mrack02）；用于容纳2个50 ml离心管或2个15 ml离心管（目录号Mrack03）
2）偶联缓冲液：0.1 M sodium phosphate, pH 7.0 or 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.6
3) 氧化试剂： Sodium meta-Periodate (NaIO4)
4）Sephadex G-25 column
5）洗涤缓冲液：1M NaCl
B. 蛋白偶联
B-1. 糖蛋白的氧化
注意：该反应对光敏感，应在黑暗中进行。
1）在1 ml偶联缓冲液中溶解或稀释0.5~10 mg糖蛋白。 （注意：如果蛋白质已经悬浮在其他缓冲液中，请通过透析脱盐柱进行缓冲液交换。
2）将蛋白质溶液添加到含有2 mg偏高碘酸钠（最终浓度为10 mM）的琥珀色小瓶中。轻轻旋转以溶解氧化剂。）
3）轻轻旋转，在室温下于黑暗中孵育样品30分钟。
4）终止反应，并通过Sephadex G25色谱柱进行脱盐和缓冲液交换，除去未反应的NaIO4。平衡5毫升。具有偶联缓冲液的Sephadex G-25色谱柱。将氧化后的样品上样至色谱柱，使其进入凝胶床。应用0.5 ml的偶联缓冲液冲洗，并使其也进入凝胶床。最后加入2 ml偶联缓冲液并收集洗脱液。
B-2. 以酰肼为末端的磁珠的偶联
注意：称重，用1mM EDTA（浓度：30 mg / ml）悬浮PuriMagTM磁珠，剧烈涡旋分散磁珠并在4°C储存。使用前先摇晃瓶子以完全重悬磁珠。
1）将完全悬浮的0.5 ml磁珠（30 mg / ml）转移到微量离心管中。
2）将离心管插入磁力分离器中1-3分钟，直到上清液澄清。当试管保留在分离器中时，用移液管吸出并丢弃上清液。从分离器中取出试管，并用1.5 ml偶联缓冲液重悬磁珠
3）重复步骤2~3次。
4）从分离器中取出离心管，并用750 µl偶联缓冲液重悬PuriMagTM磁珠。
5）将磁珠与250 µl氧化蛋白溶液混合，并在室温下孵育至少6小时。
注意：偶联效率取决于目标糖蛋白的结构和大小。使用者应根据经验优化蛋白浓度。对于10 mg磁珠，我们建议从100~250 µg/ml开始。
6）用1 ml洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。
7）用1 ml所需的存储缓冲液洗涤磁珠3次。
8）用0.1％叠氮化物（w / v）将珠子重悬于PBS缓冲液中至所需浓度，并保存在4°C直至使用。不要冻结。
C. 一般亲和纯化方案
注意：设计通用的纯化DNA或RNA的方案相对简单，因为核酸的生化特性相对一致。但是，设计一种通用的亲和纯化方案非常困难，因为每种蛋白质都有不同的组成和结构。为了获得最佳结果，每个用户都必须为各个应用程序确定最佳工作条件。
1）将最适量的PuriMagTM磁珠转移到离心管中。磁分离1~3分钟，除去上清液。
注意：强烈建议根据粗样品中目标蛋白的量进行滴定，以优化用于每种应用的磁珠的量。所用磁珠过多会导致较高背景，而所用磁珠太少则会导致较低产量。每mg的磁珠通常结合1~20 ug的目标蛋白。
2）取下离心管，用5倍磁珠体积的PBS缓冲液悬浮30秒。磁分离1~3分钟，除去上清。
3）重复步骤2两次
4）将洗涤过的磁珠加入含有目标蛋白的粗样品中，并在室温或所需温度下孵育1~2小时（较低的温度需要更长的孵育时间）。
5）用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl充分洗涤磁珠，直到280 nm洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280 <0.05）。
