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货号
规格
MS-NTA001
1 ml
MS-NTA010
10 ml
1. 产品描述
MagStart-NTA是一种专有的磁性聚合物微粒载体，用于Ni亲和捕获、纯化和回收His标签融合蛋白。MagStart微球技术的进步使生物分子可在整个微粒空间渗透和结合，提供了极高的高官能团密度允许His标签的生物分子的多点亲和捕获，从而增强靶蛋白的结合。这一特性使得在结合缓冲液中能够使用较高的咪唑浓度，从而减少杂蛋白的非特异结合，进而提高目标蛋白的纯度。MagStart-NTA可替代MagReSyn®NTA，非常适合从复杂的生物混合物（如细胞裂解物和培养上清液）中以高效纯化6×His标记蛋白。MagStart-NTA在蛋白分离前不需样品澄清（在细胞破坏后），改进了磁珠工作站自动纯化的应用。
先进的MagStart聚合物技术允许微粒进行对高度特异性的工程设计，以解决当前微粒技术的局限性。MagStart可快速磁分离（<10 秒），可防止微粒的意外丢弃而避免潜在的代价高昂的样品损失，提高了效率和回收率。这些微粒采用多种化学表面修饰，以提供超高纯度的目标蛋白，满足严格的研发和质谱样品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) of Histidine (His)-tagged proteins
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Nitrilotriacetic acid (NTA) with chelated nickel (Ni2+)
Binding capacity
≥ 1.0 mg of a His-tagged GFP/ml suspension
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
25 mg/ml in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
2. 结合和洗脱程序
可能影响6×His蛋白的Ni亲和纯化效率的几个因素为缓冲液组成和pH、污染物/干扰化合物的存在、可降解靶蛋白的蛋白酶存在及蛋白上6×His标签的位置（例如N-末端、C-末端或三明治融合标签）。MagStart-NTA在结合/洗涤和洗脱缓冲液中与8M尿素兼容。如没达到最佳性能，请参阅本指南推荐的结合/洗涤/洗脱程序及故障排除指南。
注意：所有试剂都应新制，并为分析级，以确保最佳性能。下面描述的程序、方法和缓冲液只是一个例子，并不旨在进行限制。MagStart-NTA与一系列不同的缓冲液兼容，用于结合/吸附和洗脱/解吸。可实现的纯度和产率是配体依赖性的，并且对于每种纯化的配体都应优化实验条件。
2.1. MagStart-NTA的平衡
MagStart-NTA以25 mg/ml的20%乙醇悬浮液的形式提供。使用前，需去除运输溶液，并在结合缓冲液（如80 mM磷酸钠，pH 7.4–8.0，40 mM咪唑，1.0 M NaCl）中平衡微粒。推荐的方案可以放大或缩小以满足您的要求-目前的方案估计可结合约20μg组氨酸标记蛋白。
1） 充分混合彻底悬浮MagStart-NTA磁珠。
2） 将20μl（足以结合~20μg组氨酸标记蛋白）MagStart-NTA转移到新离心管中。
3）磁分离，用移液管吸弃上清。
4） 在200μl结合缓冲液中洗涤/平衡微粒30 s。
5） 将离心管放在磁分离器上，将磁铁和离心管倒置两次，以收集盖子中残留的任何微粒。
6） 用移液枪吸除结合缓冲液，重复步骤4和5两次，总共洗涤三次。
7） 从步骤5吸去结合缓冲液后，MagStart-NTA磁珠准备好结合6×His标记的蛋白质。
2.2. 蛋白质结合程序
作为标准措施，建议在蛋白质纯化前，通过0.2μm过滤器过滤或以10000 × g离心5分钟来澄清含蛋白质的样品。
1） 将含His标记蛋白的样品添加到2.1准备好的MagStart-NTA磁珠中。用至少1体积的结合缓冲液稀释来调节结合体积（参见2.1），并充分混匀。
2） 使蛋白质样品在室温下与磁珠结合5分钟，同时进行温和的间歇混匀。
3） 将离心管放在磁性分离器上，磁分离。
4） 用移液管吸去清液或者随后用于蛋白质定量或电泳（例如确定未结合的蛋白质）。
5） 通过在200μl结合缓冲液中重悬洗涤结合蛋白，洗涤30 s，间歇涡旋。
6）磁分离，如管盖中有磁珠，将磁性分离器倒置，使液体冲洗以收集磁珠。吸弃洗涤缓冲液。
7） 重复步骤5–6两次，总共洗三次。洗涤步骤的上清液可丢弃或合并用于蛋白质定量或电泳。
2.3. 蛋白质洗脱程序
1） 将20–50μl洗脱缓冲液（80 mM磷酸钠，pH 7.4–8.0，500 mM NaCl，500 mM-咪唑）加入2.2的磁珠中。通过移液或涡流充分混合。
2） 使蛋白质在室温下洗脱2分钟。
3） 将离心管放在磁分离器上，磁分离。用移液管抽吸含有感兴趣蛋白质的洗脱液至一新离心管。
4） 为了提高其标记蛋白的回收率，用额外的20-50μl洗脱缓冲液（总共三种洗脱液）再重复步骤1-3两次。合并/汇集三种洗脱液。该蛋白质现在已准备好进行进一步的实验或分析。
2.4. 咪唑和NaCl对蛋白质结合和洗脱的影响
有效纯化所需最佳咪唑浓度将取决于靶蛋白和组氨酸标签的位置（例如N-末端、C-末端或融合物）。较低的咪唑浓度可用于促进回收率/产率，尽管可能以牺牲纯度为代价。MagStart磁珠的配方可在高达80mM咪唑的存在下结合6×His标记的蛋白质，而不会显著影响目标蛋白的回收或产量（蛋白质和标签依赖性）。虽然在结合/洗涤步骤中增加咪唑浓度可用于提高靶蛋白的纯度，但这可能导致产率的降低。对于大多数蛋白质，500mM咪唑通常足以洗脱，而其他蛋白质可能需要高达1M咪唑才能有效洗脱。在进行高咪唑洗脱前，一定要检查蛋白质功能与这些条件的兼容性。NaCl的浓度可增加到2M以减少非特异性离子相互作用，从而潜在地增加标记蛋白的纯度。建议在磁珠中加入过量的His标记蛋白，因为这可能有助于最大限度地减少非特异性相互作用，最大限度提高目标蛋白纯度。
3. 兼容性
目前方案已成功用于从含有以下任一成分的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳动物细胞裂解物中纯化蛋白质：
• Urea≤8 M • Triton® X-100≤5%
• Tween® 20≤1% • NaCl ≤2 M • Glycerol≤50%
Tris, MOPS, Sodium/Potassium phosphate≤100 mM
4. 常见问题
问题
可能原因
改善方法
蛋白质不会像预期的那样与微粒结合
不正确的结合pH
将结合缓冲液的pH至少提高到7.4
感兴趣的蛋白质降解
向粗蛋白质提取物中添加蛋白酶抑制剂
样品中干扰化合物阻止结合
将样品脱盐或透析到推荐结合缓冲液，以去除介质成分或干扰污染物
颗粒数量不足
增加磁珠的数量
蛋白含量过低
增加蛋白浓度或起始样品量来增加蛋白含量
蛋白序列不对
通过测序确认克隆
洗脱过程中蛋白质回收率低
亲和结合很强
提高洗脱液咪唑浓度
蛋白可能有金属结合结构域
增加咪唑浓度或用酸性液洗脱，如pH为3–4
蛋白质在纯化过程中发生降解
向样品和缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，以防蛋白水解。使用新制样品和溶液，尽可能减少样品制备时间，在4⁰C
蛋白在洗脱液中可能不稳定或无活性
确定感兴趣蛋白最佳pH和盐稳定性，并相应地调整方案
洗脱蛋白纯度不足（共洗脱污染蛋白）
洗涤效率低
增加洗涤次数和体积及洗涤液NaCl浓度（最高2M）。将洗涤液中咪唑浓度提高至80mM
靶蛋白的特异性降解
缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解
靶蛋白不完全
使用的微粒数量不足
增加用于纯化的MagStart-NTA的数量
洗脱后靶蛋白无活性
咪唑或缓冲盐的干扰
通过透析、过滤、沉淀或排阻色谱去除咪唑或缓冲盐。降低咪唑浓度以进行洗脱或在酸性缓冲液中洗脱，例如pH为3-4的柠檬酸盐；用合适碱性缓冲液洗脱后立即降低pH。
不兼容下游应用
咪唑、缓冲剂或盐的干扰
通过透析、过滤、沉淀或排阻色谱去除咪唑。
参考文献：
1. Acosta J, Nguyen K, Spitale R C, et al. Taylor-made production of pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues by highly stabilized mutant uracil phosphoribosyltransferase from Toxoplasma gondii[J]. Bioresource Technology, 2021, 339: 125649.
