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货号
规格
MS-HLC001
1 ml
MS-HLC010
10 ml
1. 产品描述
MagStart-HILIC（亲水作用色谱）是一种专有磁性聚合物微球，用于固相萃取 （SPE） 和从可能干扰下游分析程序的含污染物样品中回收生物分子，用于质谱分析的样品制备。MagStart-HILIC微球具混合模式功能，可对生物分子产生高亲和力，随后以小体积洗脱，从而在样品处理过程中实现浓缩。MagStart-HILIC是复杂生物混合物（如培养上清液、组织提取物、血清或血浆）样品制备的理想选择，通过电泳、HPLC和质谱分析样品之前，从常规污染物（如SDS、CHAPS、NP-40和尿素）中制备样品。磁辅助进一步实现了常规质谱净化工作流程的自动化，提高了重现性和数据质量。
先进的MagStart聚合物技术允许微粒进行对高度特异性的工程设计，以解决当前基于微粒的技术的局限性。MagStart可快速磁分离（<10 秒），可防止微粒的意外丢弃而避免潜在的代价高昂的样品损失，提高了效率和回收率。这些微粒采用多种化学表面修饰，以提供超高纯度的目标蛋白，满足严格的研发和质谱样品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Protein purification, proteomics, mass spectrometry sample preparation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
HILIC, Mixed Mode
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
2. 结合和洗脱程序
HILIC（亲水作用液相色谱法）是通过施加有机流动相，将两亲性生物分子捕获在固定相表面形成的富水层之间的过程。这种机制用于将生物分子与极性较低化合物分离。氢和弱静电相互作用与生物分子在水层的保留有关，而离子添加剂（如醋酸铵和甲酸铵）常用于控制样品pH值和离子强度。
注意：目前方案适用于MS分析中胰蛋白酶消化之前净化还原和烷基化蛋白质，并且尚未评估肽的净化。有关适合MS的工作流程示例，请参阅文献。
注意：所有试剂应新鲜制备，并具有分析级，以确保最佳性能。下面描述的程序、方法、缓冲溶液和配体仅供参考，并非旨在限制。纯度和产量取决于实验条件，应针对每种应用单独优化。
2.1. MagStart-HILIC的平衡
MagStart-HILIC以 20 mg/ml悬浮于20% 乙醇液的形式提供。使用前需要去除运输溶液，并在结合缓冲液中平衡微粒。可根据推荐的方案按比例放大或缩小以满足您的要求，但每个反应至少需要10μl微粒悬浮液的体积，以确保合适的磁性微粒沉淀用于缓冲液的抽吸。当前方案经优化，可在25μl样品体积内将50μg总蛋白与500μg磁珠（蛋白质与磁珠比例1：10）结合（该协议的最小值）。该程序已被证明在低至20 μg的总蛋白浓度下有效。
1）通过涡旋混合3秒彻底重悬MagStart-HILIC，以确保悬浮液均匀。
2）将 25 μl （500 μg）磁珠转移到新的 2 ml离心管中（建议低蛋白结合以提高样品回收率）。
3）磁分离，待上清液澄清。
4）用移液枪吸取出上清液并丢弃。
5）在250μl平衡缓冲液中洗涤平衡微粒，混匀1分钟。磁分离，吸弃上清。重复该步骤1次。
6）去除结合缓冲液后，磁珠即可用于结合蛋白。
2.2. 蛋白质结合程序
蛋白应提取并溶解在含合适去污剂或离液剂的低摩尔浓度缓冲液（如 50 mM Tris pH 8.0）中，以增加蛋白样品的溶解度。该方案已被证明可有效从50mM Tris pH 8.0或PBS的细胞裂解物中去除高达5%的SDS，2%CHAPS，1%NP40或8M尿素；制备这些相容的蛋白质溶解剂。如在质谱分析前需酶消化，则应在磁珠纯化前对样品还原和烷基化。
1）用蛋白质溶解缓冲液将样品调节至最小25μl，并加入等体积（1：1）结合缓冲液，最终体积为50μl（最小）。
注意：结合程序适用于体积增加的样品（例如，在蛋白质浓度较低的情况下）。
2）将样品加入平衡的磁珠中，移液器吹打混合。
3）让蛋白质与微粒结合30分钟。轻柔而连续地混合，以确保在结合过程中样品微粒相互作用良好。
4）磁分离，吸除上清液（注意：可以分析上清液以确定是否存在未结合的蛋白质）。
5）将珠子重悬于200μl洗涤缓冲液并充分混合。磁分离，吸除上清液。重复该洗涤步骤1次。
6）继续执行2.3进行蛋白质消化，或继续进行替代程序2.4进行蛋白质洗脱。
2.3. 蛋白质消化程序
将含有结合蛋白质的MagStart-HILIC 微粒直接施加到胰蛋白酶溶液中，可用胰蛋白酶等酶消化蛋白质。所得肽进行质谱分析，无需进一步纯化。注意：为确保有效消化，在HILIC纯化之前，应还原和烷基化蛋白质（根据标准方案）。
1）将微粒与2.2吸附的蛋白质混合物重悬于50-200μl合适的消化缓冲液中，例如含有消化酶的5-10mM碳酸氢铵。对于测序级胰蛋白酶，我们建议酶与蛋白质的比例为1：10。
2）根据酶规格在合适温度和时间段内孵育样品。对于测序级胰蛋白酶，建议37°C下孵育 4 小时。
3）磁分离，用移液管吸出含有肽的上清液。
4）根据需要进行真空干燥或冻干以浓缩肽样品。
5）MS分析时重悬肽，例如2%乙腈和0.2%甲酸。
6）进行质谱分析。
2.4. 蛋白质洗脱程序（替代上述 2.3）
1）将微粒与吸附的蛋白质混合物（来自2.2）重悬于50μl洗脱溶液中，并在室温下解吸5分钟。连续混合以确保微粒在洗脱过程中保持悬浮状态。
2）磁分离，并用移液枪吸出上清液（含蛋白质）。
3）可重复步骤1-2，提高蛋白质回收率。
4）混合洗脱液，必要时冻干或真空过滤浓缩。
注意：对于蛋白质含量低的样品，在分析之前可能需要样品的浓缩（例如真空干燥或冻干）。
3. 推荐缓冲液
平衡缓冲液：100 mM乙酸铵，pH 4.5，15%乙腈
结合缓冲液：200 mM乙酸铵，pH 4.5，30%乙腈
洗涤缓冲液：95%乙腈（5%水）
洗脱液：100%乙醇 ；酸溶液：10%甲酸
4. 兼容性
目前方案已成功用于从含有以下任一成分的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳动物细胞裂解物中纯化蛋白质：
• 8 M Urea • 4% SDS
• 2% CHAPS • 1% NP40
目前方案不适用于从含有以下组分的哺乳动物细胞裂解物中纯化蛋白质：
• 6 M 盐酸胍溶于 50 mM Tris，pH 8.0
5. 常见问题
问题
可能原因
改善方法
低蛋白结合
乙腈浓度低
确保结合前样品最终乙腈浓度为15%，评估乙腈浓度增加至80%。监测乙腈浓度增加时潜在的蛋白质沉淀。
含盐量高
降低盐浓度以增加吸附。盐浓度不应超过 100 mM。
样品中不相容的试剂
调整样品制备，仅包括兼容的离液剂和HILIC缓冲液。在使用磁珠进行净化前稀释离液剂或增溶剂。
混合不足
使用 2 ml Protein LoBind 试管，确保易于混合并减少微粒对试管侧壁的吸附。
酶解后的序列覆盖率低或质谱信号低
消化不完全。
确保最佳制备和消解条件：确保样品被有效还原和烷基化；消化pH =8；合适蛋白/酶比例；37°C消解。如必要，增加消化时间。
肽回收率低或洗脱不完全
消化后清洗微粒以提高回收率。通过对结合和洗脱样品进行凝胶分析，确保蛋白质与微粒结合。
蛋白质浓度低
通过真空干燥或冻干在质谱分析之前减少样品量。
变性剂去除不完全
杂质残留
需要使用额外的乙腈清洗剂进行更严格清洗程序。
交替操作过程中蛋白洗脱不完全
将结合缓冲液的摩尔浓度降低至 20 至 50 mM 之间，以减少珠子-蛋白相互作用。
