羟基磷灰石修饰的磁珠（hydroxyapatite magnetic bead）是硅基磁珠经羟基磷灰石官能团改性制得。 该珠子是非常有用的色谱介质，可用于快速纯化和分馏各种生物物质，如蛋白质和抗体，无需繁杂的重复移液和离心。 羟基磷灰石有两个不同的吸附位点; 与酸性基团结合的钙位点和与碱性蛋白质基团相互作用的磷酸盐位点。 由于其独特的混合模式“离子交换特性，羟基磷灰石不仅具有独特的分离性能，无与伦比的选择性和分辨率，而且对蛋白质和抗体具有非常大的结合能力。 此外，羟基磷灰石不结合游离氨基酸或小肽，使其对蛋白质纯化非常有利。
产品名称
PuriMag Si-HA; PuriMag Si-[Ca5(PO4)3OH]2
浓度
50mg / ml
平均尺寸
0.4μm（+/-0.04μm）
材料
硅基磁性材料
磁分离
<30 S
储存
2-8°C软化水中
结合能力
>20ug protein (BSA)/mg bead
比表面积
~100m2/g
一、蛋白纯化方案
注意：以下方案是采用PuriMag Si-HA羟基磷灰石修饰的磁珠纯化蛋白质的实例。为获最佳结果，用户可用替代的结合、洗涤或洗脱缓冲液，并鼓励根据注释部分中描述的方案和建议确定最佳工作条件。我们建议进行滴定以优化每种应用所需磁珠的量。 可相应地缩放洗脱体积以避免不必要的样品稀释。
l 建议将一水磷酸二氢钠和七水合磷酸氢二钠用于预处理缓冲液和结合/洗涤缓冲液配制。
l 避免使用无水磷酸钠，因为这些盐含有阻止一些大分子结合的焦磷酸盐。
l 避免高浓度的盐或螯合剂如EDTA，因为它们会阻止蛋白质与磁珠结合。
l 氯化钙可以加入磷酸盐缓冲液中以提高结合效率，用于酸性蛋白质纯化。
磷酸盐缓冲液中氯化钙浓度: 0.3 mM calcium chloride for 10 mM phosphate buffers; 0.01 mM calcium chloride for 300 mM phosphate; 0.0075 mM calcium chloride for 400 mM phosphate.
l 预处理缓冲液: 200 mM Sodium phosphate, pH 9-10
l 结合/洗涤缓冲液: 10 mM Sodium phosphate, pH 6.8, 0.3 mM calcium chloride
l 洗脱缓冲液: Gradient of increasing concentration of 10-600 mM potassium phosphate, pH 7.0
A.样品准备：将蛋白质样品置于50倍体积的结合缓冲液进行透析。
B.磁珠准备 注意：用100 mM磷酸钠，20%乙醇（磁珠浓度：50 mg / ml）悬浮磁珠，并在4℃下储存.（可能需要非常轻柔地超声处理珠子完全分散珠子。）
1）摇动瓶子，使磁珠完全重悬。将40μl磁珠（2mg）转移到离心管中。磁分离，除去上清液。
2）用200μl预处理缓冲液重悬磁珠，室温下2-3分钟。磁分离，除上清液。重复该步骤一次。
3）从分离器中取出离心管，用200μl结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。磁分离，除去上清液。重复该步骤一次。
4）用100μl结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。
C.样品结合
1）将含~40μg蛋白质的样品加入上述洗过的磁珠中。用移液枪充分混合磁珠，在室温下放置2-3分钟。
2）将试管放在磁分离器上1-3分钟，除去上清液。
3）取出离心管，用200μl结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠。磁分离，除去上清液。.重复该步骤三次。
D.蛋白质洗脱：注意：蛋白质可用浓度逐渐增加的磷酸盐缓冲液（10-600 mM）和/或pH梯度（5.5或更高，达到样品蛋白质的稳定性极限）或NaCl用于碱性蛋白质洗脱，但是不是酸性蛋白质。
1）从分离器中取出管子。用10-20μl洗脱缓冲液重悬珠子，并在室温下放置3分钟。
2）将管置于磁分离器上1-3分钟，将含洗脱蛋白的上清液转移到新离心管中。
二、DNA纯化方案 注意：对于所有缓冲液配制，建议采用一水磷酸二氢钠和七水合磷酸氢二钠。避免使用无水磷酸钠，因为这些盐含有焦磷酸盐，会阻止某些大分子结合。
l 样品裂解缓冲液：8M Guanidine hydrochloride
l 结合/洗涤缓冲液：100 mM phosphate buffer pH 7, 4 M guanidine hydrochloride
l 洗脱缓冲液：0.5M phosphate buffer pH 7 (4M guanidine hydrochloride -optional)
l 稀释缓冲液：0.2 M phosphate buffer pH 7
A.样品准备：样品预处理是成功纯化高质量基因组的关键步骤。不同生物样品需不同方法裂解细胞释放DNA。许多培养的细胞可在裂解液涡旋均质化，而动物/植物组织、酵母和细菌需更严苛裂解过程。不同样品参考下表。
Sample
Soft tissue
Hard tissue
Plant tissue
Fungi
Yeast
Bacterium
Liquid nitrogen
+
Frozen grinding
Homogenize
Lysozyme
Lyticase, zymolase
Sonication
Glass bead grinding
1）将100mg预处理的生物质溶于1ml样品裂解液。为促进裂解，55℃摇床中下孵育1h至过夜。
2）在室温下以13,000rpm离心3~5分钟除去细胞碎片。将上清液转移到新管中，用2×稀释缓冲液将上清液浓度调至4M盐酸胍。
B. 磁珠准备
1）摇动瓶子，重悬磁珠。将20μl-30μl磁珠（50mg / ml）转移至离心管中。磁分离，除去上清液。
2）用200μl结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。置于室温下2-3分钟。磁分离，除去上清液。重复该步骤三次。
3）用100μl结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。
1）将样品与磁珠混合，室温下温育10-15分钟，同时轻轻旋转。磁分离，除去上清液。
2）用200μl结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠。磁分离，除去上清液。重复该步骤三次。
D. DNA洗脱：从分离器中取出离心管，用10-50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，在室温下放置3分钟。磁分离，然后将含有洗脱DNA的上清液转移到新试管中。
E. DNA沉淀
1）向洗脱的DNA溶液中加入等体积的d2H2O。加入0.1倍体积的5M乙酸铵和2.5倍体积的100%EtOH，使DNA在-20℃下沉淀至少15分钟（优选1小时或更长）。
3）以13,000rpm离心15分钟。弃上清液。向沉淀中加入2ml冰冷的70％乙醇并轻弹/搅拌管以重悬沉淀。
4）以13,000rpm离心15分钟。丢弃上清液。让DNA风干（15分钟即可）。将DNA重悬于适量的d2H2O或TE缓冲液中（注意：基因组DNA不易溶解，65°C下5分钟有助于溶解）。
