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货号
规格
MS-PRA001
1 ml
MS-PRA010
10 ml
1. 产品描述
蛋白A磁珠MagStart-Protein A是一种专有的磁性聚合物微粒，提供了一种简单方便的抗体捕获方法，适合后续各种靶分子富集，以及生物样品中各种抗体/免疫球蛋白的高度特异性富集。MagStart磁珠是一种超多孔聚合物网络，允许生物分子在整个微粒内渗透和结合。MagStart-Protein A的高载量反过来又转化为靶生物分子的极高结合量。与MagReSyn®Protein A有等同效果。
重组蛋白A（~41 kDa）与磁微粒共价连接，可提高蛋白质的稳定性，从而有可能使蛋白质在非标准条件下应用。共价键有助于减少蛋白A从磁珠泄漏。MagStart蛋白A与其它市售蛋白A磁微粒相比有更出色的抗体结合能力，抗体纯度高达97%以上，可舍去其它纯化分离步骤。蛋白A磁珠的应用包括血清样品中的免疫球蛋白去除、抗体分离以及后续抗体靶标免疫沉淀，用于下游应用，例如：通过质谱、免疫测定或电泳进行分析。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of IgG molecules, Immunoprecipitation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Protein A (~41kDa)
Binding capacity
≥2.4 mg/ml IgG (Rabbit)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
15 mg/ml in TBS [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% Tween® 20, 0.05% sodium azide (NaN3)]
Stability
pH 2~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
MagStart-Protein A微粒极高的官能团密度为生物分子偶联提供了高浓度的反应位点。MagStart-Protein A的高结合载量允许减少高活性功能微粒的体积来实现实验方案小型化，进而最大限度地减少所需试剂的体积，从而允许以更小的体积应用固定化配体。MagStart可快速磁分离（<10 秒），通过磁压缩减少了洗涤和洗脱过程中颗粒间隙，从而提高了效率和回收率，强磁性还可防止微粒的意外丢弃而避免样品损失。
2. 免疫球蛋白纯化流程
可能影响抗体附着的因素包括免疫球蛋白的同种型、缓冲液组成和 pH 值，以及污染物/干扰化合物的存在。磁珠的数量需要针对每个单独的应用进行优化。我们建议使用过量的配体来确保蛋白A磁珠的饱和度。结合效率可以通过比较偶联前后的配体浓度来确定。MagStart-Protein A与各种常用缓冲液兼容，推荐的缓冲液包括：
结合/洗涤缓冲液 - TBS（pH 7.5, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.025% Tween 20）或 PBS（pH 7.5, 50 mM Phosphate, 150 mM NaCl，0.025% Tween 20）；
洗脱缓冲液（非变性）：0.1 M glycine，pH 2.5 或 2.5% acetic acid；
洗脱缓冲液（变性）：SDS-PAGE eletrophoresis buffer。
注意：所有试剂都应是分析级且新鲜制备，以确保最佳性能。下面的程序、方法和缓冲液仅供参考，并非限制。MagStart-Protein A与一系列不同缓冲液兼容，用于结合抗体。可实现的纯度和产率取决于配体，应优化实验条件以确保获得预期结果。
关于MS兼容性的注意事项：如要通过MS进一步分析富集的靶标，请考虑在初始洗涤步骤后使用替代的无去垢剂缓冲液，以去除可能干扰MS分析的残留去垢剂。这可能包括不加洗涤剂的初始缓冲液，然后用挥发性无盐缓冲液（如碳酸氢铵、甲酸铵、三乙基碳酸氢铵）洗涤 2-3 次。
2.1. MagStart-Protein A磁珠的平衡
磁珠以15 mg/ml的TBS悬浮液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.025%Tween®20和0.05% NaN3作为防腐剂）的形式提供，适用于纯化≥2.4 mg/ml的IgG（兔）。在使用前，需去除运输溶液并在结合缓冲液中平衡磁珠。对蛋白A磁珠的等分试样进行多重结合反应，如下所述。每次反应至少需要10µl的微粒悬浮液，以确保缓冲液的抽吸具有合适的颗粒尺寸。下面概述的结合和洗脱方案可作为示例，并可根据您的要求进行缩放。
1） 通过涡流混合或倒置彻底分散MagStart-Protein A磁珠，以确保均匀悬浮。
2） 转移50µl 磁珠（足以捕获约120µg兔IgG）到新的管中。
3） 磁分离，吸弃运输溶液。
4） 加入300µl结合缓冲液（例如TBS或PBS）中洗涤/平衡磁珠，允许磁珠平衡至少1分钟。
5） 将离心管放在磁分离器上，澄清后移液管吸弃结合缓冲液。
6） 重复步骤4和5两次（总共3次洗涤）。
7） 从步骤6中去除结合缓冲液后，MagStart-Protein A准备就绪，可用于结合靶免疫球蛋白。
2.2. 从血清或培养液中纯化免疫球蛋白 (Ig)
1) 计算应用所需的MagStart-Protein A磁珠的体积，并转移到干净的离心管中。例如，50 µl 蛋白A磁珠（0.75 mg）足以结合 ≥ 120 µg 兔 IgG。
2) 用至少 90 µl 结合/洗涤缓冲液稀释 10 µl 样品，涡旋搅拌 3 秒。样品量可根据需要调整，但至少要用9份结合缓冲液来稀释样品（如，100 µl 样品和900 µl 缓冲液可与 50 µl磁珠一起使用）。
3) 通过倒置或涡旋搅拌将样品与磁珠混合。室温下孵育至少10分钟，以确保蛋白A与免疫球蛋白之间的有效结合。结合效率与时间和配体有关，孵育时间可延长至1小时，以提高抗体产量。
4) 将试管放在磁分离器上，磁分离澄清。
5) 用移液管吸出偶联上清液。上清液可丢弃或分析以确定 Ig 容量。
6) 用至少3×500 µl结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠，去除磁珠上未结合Ig和/或不需要的样品蛋白质。
7) 每次洗涤后，磁分离，用移液管吸出上清液。
8) 各洗涤步骤的上清液可与偶联上清液混合进行定量或凝胶电泳（如需要）。
9) 现在可以按 2.3 中所述从微粒中洗脱捕获的 Ig，或用于免疫沉淀（3.1；从步骤 7 开始）。
10) 可选： 此时可将结合的抗原或抗体进行脱盐或缓冲液替换，方法是用适合下游应用的缓冲液/水进行洗涤。
2.3. 回收/洗脱捕获的免疫球蛋白
捕获的免疫球蛋白可通过加入低 pH 值的洗脱缓冲液（如 pH 值为 2.5 的 0.1 M 甘氨酸或 2.5% 乙酸）从微颗粒中洗脱出来。
1) 向包被捕获 Ig 的 磁珠中加入 50 µl 洗脱缓冲液，持续充分混合。洗脱体积可根据要求调整；但洗脱体积过低可能会对Ig产量产生不利影响。
2) 让捕获的 Ig 在室温下从微粒中洗脱1-2分钟。
3) 磁分离，移液管吸出含洗脱的溶液。该溶液可用于量化洗脱Ig的浓度，或用凝胶电泳分析。
4) 可重复步骤1-3，以提高洗脱的回收率。
5) 汇总洗脱液，加入 5-7 µl 的5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0 中和洗脱液的 pH 值。
6) 纯化的Ig可用于定量或下游分析。
3. 免疫沉淀流程
MagStart-Protein A磁珠还可用于直接或间接免疫沉淀（IP）反应的抗体捕获。对于直接 IP，用户指定的抗体（Ab）首先通过蛋白 A-抗体介导的结合与磁珠相连。这些免疫亲和磁珠随后用于从血清或细胞裂解物等粗样品中特异性捕获感兴趣的抗原（如生物大分子、蛋白质、蛋白质复合物）。IP 的另一种方法是先将用户指定的抗体与含抗原的样品孵育，形成抗原-抗体复合物。然后将用Protein A磁珠进行捕获。间接 IP 可能还包括通过使用第二抗体（通过亲和捕获固定在 MagStart-Protein A磁珠上的抗抗体）从样品中捕获抗原抗体复合物。
3.1. 免疫沉淀 (IP) 程序
由于 IP 有多种变化，以下方案仅指导原则作示例。具体的 IP 参数可能会发生变化，因此需进行优化，这些参数包括：抗体和配体的数量、样品浓度、孵育时间、温度和缓冲液成分、样品浓度、孵育时间、温度和缓冲液成分。 以下方案可根据需要进行调整，用于直接或间接 IP洗脱。
1) 按照 2.1.步骤 1-6 准备蛋白 A 磁珠并平衡。
2) 去除最后的结合/洗涤缓冲液后，用 100 µl 结合/洗涤缓冲液重悬MagStart-Protein A磁珠。
3) 在磁珠悬浮液中加入捕获抗体（每 50 µl 最多 120 µg）。
4) 室温孵育10-30分钟使捕获抗体固定在磁珠上。
5) 磁分离，吸出抗体溶液（弃掉或用于定量）。
6) 用 300 µl 结合缓冲液（如 TBS 或 PBS）洗涤磁珠三次。
7) 最后一次洗涤后，将离心管从磁力架上取下，加入含目标抗原样品（最终体积至少为 500 µl，用于末端混合）。
8) 轻轻倒置混合均匀，在 2-8°C下持续混合孵育。抗体与抗原相互作用的最佳时间可能会有所不同（请参考抗体制造商推荐的孵育时间；通常范围为 1 小时至过夜）。
9) 磁分离吸出样品溶液，丢弃或用于下游分析。
10) 用 300 µl 结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。洗涤液可与步骤 9 中的样品溶液合并进行分析。
11) 可选： 此时可将结合的抗原或抗体进行脱盐或缓冲液交换，方法是用适合下游应用（如质谱分析）的缓冲液/水进行洗涤。
12) 抗体、抗原或抗体-抗原复合物可根据 2.3 从微粒中洗脱出来。
4. 抗体结合指引
5. 试剂适应性
MagStart-Protein A 磁珠相容组成如下:
Reagent
Concentration
Tween® 20
≤1%
Tris, Sodium phosphate, Triethanolamine
≤100 mM
NaCl
≤1 M
6. 常见问题
问题
可能原因
改善方法
抗体未如预期那样与微粒结合
反应时间不足
将反应时间扩充到1小时
不正确的结合pH
检查和调整结合液pH7.4-8.0
样品或溶液中的干扰物阻止结合
将样品脱盐或透析到推荐的结合液中，以去除培养基成分/其他污染物
微粒数不足
增加颗粒的数量
生物分子含量过低
通过样品浓度增加抗体含量或制备更多起始材料
抗体与蛋白A不相容
蛋白A并非多所有抗体特异
生物分子的非特异吸附
离子或静电作用导致的非特异吸附
增加结合、洗涤、洗脱缓冲液中的NaCl浓度；增加结合洗涤液中吐温20浓度
洗涤不充分
增加洗涤次数、洗涤液体积和平衡时间
低的看题洗脱回收率
洗脱条件太温和
增加洗脱时间，替换洗脱缓冲液，务必保证洗脱缓冲液pH<3.0
洗脱后蛋白失活
蛋白在洗脱液中可能不稳定或失活
替换洗脱缓冲液，或立即使用5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0中和洗脱液
参考文献：
1. Maimela P W M, Smith M, Nel A J M, et al. Humoral immunoprofiling identifies novel biomarkers and an immune suppressive autoantibody phenotype at the site of disease in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Frontiers in Oncology, 2024, 14: 1330419.
